Analisi trascrittomica di<em> C</em>.<em> elegans</em> RNA Sequencing dati attraverso la suite Tuxedo sul Progetto Galaxy

Il primo sequenziamento del genoma umano, effettuata con il metodo dideoxynucleotide-sequenziamento di Fred Sanger, sono voluti 10 anni, con un costo stimato US $ 3 miliardi di ^{1, 2.} Tuttavia, in poco più di un decennio, sin dal suo inizio, Next-Generation Sequencing Technology (NGS) ha reso possibile sequenziare l'intero genoma umano entro due settimane e per US $ 1.000. Nuovi strumenti che permettono di NGS sempre crescente velocità di raccolta sequenziamento-dati con incredibile efficienza, con una riduzione dei costi vivi, stanno rivoluzionando la biologia moderna in modi inimmaginabili, come i progetti di sequenziamento del genoma stanno rapidamente diventando un luogo comune. Inoltre, questi sviluppi hanno galvanizzato progressi in molti altri settori quali l'analisi dell'espressione genica mediante RNA-Sequencing (RNA-Seq), studio delle modificazioni epigenetiche tutto il genoma, interazioni DNA-proteina e screening per la diversità microbica in ospiti umani. NGS a base di RNA-Seq in particolare, ha permesso di identificare e mappare trascrittomi completo con accuratezza e sensibilità, e ha sostituito microarray come metodo di scelta per profili di espressione. Mentre la tecnologia microarray è stato ampiamente utilizzato, è limitata dalla sua dipendenza array preesistenti con nota informazione genomica e altri inconvenienti come ibridazione incrociata e ristretta gamma di cambiamenti di espressione che può essere misurato in modo attendibile. RNA-Seq, d'altra parte, può essere utilizzato per rilevare sia le trascrizioni noti e ignoti, mentre la produzione a basso rumore di fondo a causa della sua natura ambigua mappatura del DNA. RNA-Seq, insieme ai numerosi strumenti genetici offerti da organismi modello come il lievito, mosche, vermi, pesci e topi, ha servito come base per molti recenti scoperte biomediche importanti. Tuttavia, permangono delle sfide significative che compongono NGS inaccessibili alla comunità scientifica più ampia, comprese le limitazioni di conservazione, elaborazione, e la maggior parte di tutti, m analisi bioinformatica eaningful di grandi volumi di dati di sequenziamento.

I rapidi progressi nelle tecnologie di sequenziamento e l'accumulo esponenziale dei dati hanno creato un grande bisogno di piattaforme computazionali che permetteranno ai ricercatori di accedere, analizzare e comprendere queste informazioni. I primi sistemi erano fortemente dipendente dalla conoscenza di programmazione di computer, mentre, i browser genoma quali NCBI che hanno permesso ai non programmatori di accedere e visualizzare i dati non permetteva analisi sofisticate. La piattaforma web-based, ad accesso aperto, Galaxy ( https://galaxyproject.org/ ), ha riempito questo vuoto e dimostrato di essere un oleodotto prezioso che consente ai ricercatori di elaborare i dati NGS ed eseguire uno spettro di semplice da complessi analisi bioinformatica. Galaxy è stato inizialmente stabilito, ed è mantenuto, dai laboratori di Anton Nekrutenko (Penn State University) e James Taylor (Johns Hopkins University)f "> 3. Galaxy offre una vasta gamma di compiti computazionali che lo rende un 'one-stop shop' per le esigenze di bioinformatica innumerevoli, compresi tutti i passaggi necessari per uno studio di RNA-Seq. Itallows agli utenti di eseguire l'elaborazione dei dati sia sui propri server o localmente sulle proprie macchine. i dati e flussi di lavoro possono essere riprodotti e condivisi. tutorial online, sezione di aiuto, e un wiki-page ( https://wiki.galaxyproject.org/Support ) dedicato al Progetto Galaxy forniscono un supporto costante. Tuttavia, per prima volta gli utenti, in particolare quelli con nessuna formazione bioinformatica, la pipeline può apparire scoraggiante e il processo di auto-apprendimento e di familiarizzazione può richiedere molto tempo. Inoltre, il sistema biologico studiato, e le specifiche di questo esperimento e metodi utilizzati, l'impatto le decisioni di analisi in diversi passaggi, e questi possono essere difficili da navigare senza istruzioni.

Il complesso RN A-Seq Galaxy Workflow consiste di caricamento dei dati e di controllo della qualità seguita da analisi usando l'smoking Suite ^{4, 5, 6, 7, 8, 9,} che è un collettivo di vari strumenti necessari per le diverse fasi di analisi dei dati RNA-Seq ^{10, 11, 12, 13, 14.} Un tipico esperimento RNA-Seq consiste nella parte sperimentale (preparazione del campione, l'isolamento di mRNA e preparazione di cDNA library), il NGS e l'analisi bioinformatica dei dati. Una panoramica di queste sezioni, e le fasi coinvolte nella pipeline Galaxy, sono mostrati in Figura 1.

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Figura 1: Sintesi di un Workflow RNA-Seq. Illustrazione delle fasi sperimentali e computazionali coinvolti in un esperimento RNA-Seq di confrontare i profili di espressione genica di due ceppi di vite senza fine (rispettivamente A e B, le linee arancioni e verdi e frecce,). I diversi moduli Galaxy utilizzati sono mostrati in scatole con passo corrispondente nel nostro protocollo indicato in rosso. Le uscite di varie operazioni sono scritte in grigio con i formati di file indicati in blu. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Il primo strumento nel Tuxedo Suite è un programma di allineamento chiamato 'Tophat'. Si rompe l'ingresso NGS si legge in frammenti più piccoli e poi li associa ad un genoma di riferimento. Questo processo in due fasi assicura che legge regioni ponte introniche cui allineamento può altrimenti essere disrupted o mancati sono contabilizzati e mappati. Questo aumenta la copertura e facilita l'identificazione di nuovi giunzioni di splicing. Uscita Tophat viene segnalato come due file, un file LETTO (con informazioni sulle giunzioni di splicing che comprendono posizione genomica) e un file di BAM (con i dettagli di mappatura di ogni lettura). Successivamente, il file BAM è allineato contro un genoma di riferimento per stimare l'abbondanza delle singole trascrizioni all'interno di ogni campione usando il successivo strumento nel Tuxedo Suite chiamata 'Gemelli'. Gemelli funzioni di scansione l'allineamento di riferire frammenti trascrizione full-length o 'transfrags' che si estendono su tutte le possibili varianti di splicing nei dati di input per ogni gene. Sulla base di questo, si genera un 'trascrittoma' (assemblea di tutti i trascritti generati per gene per ogni gene) per ogni campione viene sequenziato. Questi gemelli assembly vengono poi compresso o fuse insieme lungo con la rirenza genoma per produrre un singolo file di annotazione per l'analisi differenziale a valle usando l'utensile successivo, 'Cuffmerge'. Infine, il 'Cuffdiff' utensile misure differenziale espressione genica tra i campioni confrontando le uscite Tophat di ciascuno dei campioni al file di output Cuffmerge finale (Figura 1). Gemelli utilizza FPKM / RPKM (Frammenti / Legge Per kilobase di trascrizione per milione mappato letture) valori segnalare abbondanze trascrizione. Questi valori riflettono la normalizzazione dei dati NGS prime per profondità (numero medio di letture da un campione che si allineano al genoma di riferimento) e la lunghezza del gene (geni hanno lunghezze diverse, in modo conteggi devono essere normalizzati per la lunghezza di un gene per confrontare i livelli tra geni). FPKM e RPKM sono essenzialmente le stesse con RPKM utilizzato per single-end RNA-Seq dove ogni lettura corrisponde ad un singolo frammento, che, FPKM serveabbinato-end RNA-Seq, in quanto rappresenta il fatto che due letture possono corrispondere allo stesso frammento. In definitiva, il risultato di queste analisi è una lista dei geni differenzialmente espressi tra le condizioni e / o ceppi testati.

Una volta che una corsa Galaxy successo è completato e viene generato una 'lista gene', il passo logico successivo richiede più bioinformatica analisi dedurre conoscenze significative da set di dati. Molti pacchetti software sono emerse per soddisfare questa esigenza, inclusi i pacchetti computazionale basati sul web pubblicamente disponibili come David (il database per l'annotazione, la visualizzazione e la scoperta Integrata) ^15. DAVID facilita l'assegnazione di significato biologico di grandi liste di geni provenienti da studi ad alto throughput confrontando la lista gene caricato al suo knowledge base biologica integrata e rivelando le annotazioni biologiche associate con l'elenco dei geni. Questo è seguito da analisi arricchimento, cioè, prove a identify se qualsiasi processo o gene classe biologica è sovrarappresentato nella lista gene (s) in un modo statisticamente significativo. E 'diventato una scelta popolare a causa di una combinazione di un ampio, base di conoscenze integrata e algoritmi di analisi potenti che consentono ai ricercatori di individuare temi biologici arricchiti entro genomica-derivato 'liste di geni' ^{10, 16.} Ulteriori vantaggi sono la sua capacità di elaborare liste di geni creati su qualsiasi piattaforma di sequenziamento e un'interfaccia altamente user-friendly.

Nematode Caenorhabditis elegans è un sistema modello genetico, ben noto per i suoi numerosi vantaggi come piccole dimensioni, corpo trasparente, semplice corpo piano, facilità di coltura e grande amenability per dissezione genetica e molecolare. Vermi hanno una piccola, semplice e ben annotato genoma che comprende fino al 40% geni conservati con noti omologhi umani ^17. Infatti, C. elegansè stato il primo metazoo cui genoma è stato completamente sequenziato ^18, e una delle prime specie dove RNA-Seq è stato usato per mappare transcriptome di un organismo ^{19, 20.} I primi studi verme coinvolto la sperimentazione di metodi diversi per high-throughput di cattura RNA, preparazione biblioteca e sequenziamento così come condutture di bioinformatica che hanno contribuito al progresso della tecnologia ^{21, 22.} Negli ultimi anni, la sperimentazione RNA-Seq-based nei vermi è diventato un luogo comune. Ma, per i biologi vite senza fine tradizionali le sfide poste dalla analisi computazionale dei dati di RNA-Seq rimangono uno dei principali ostacoli per una maggiore e migliore utilizzo della tecnica.

In questo articolo, si descrive un protocollo per l'utilizzo della piattaforma Galaxy analizzare alto throughput dati RNA-Seq generati da C. elegans. Per molti la prima volta e piccole-SCALe utenti, il modo più conveniente e semplice da intraprendere un esperimento RNA-Seq è quello di isolare l'RNA in laboratorio e utilizzare una commerciale (o in-house) impianto NGS per la preparazione di librerie di cDNA sequenziamento e l'NGS stesso. Quindi, abbiamo prima descritto le fasi in isolamento, quantificazione e valutazione della qualità di C. elegans campioni di RNA per l'RNA-Seq. Successivamente, forniamo istruzioni passo-passo per l'utilizzo dell'interfaccia Galaxy per analisi dei dati NGS, iniziando con test per la post-sequenziamento alcun controllo di qualità seguiti da allineamento, assemblaggio, e differenziale quantificazione dell'espressione genica. Inoltre, abbiamo incluso le indicazioni per scrutare le liste di geni derivanti da Galaxy per gli studi di arricchimento biologici con David. Come passo finale nel flusso di lavoro, mettiamo a disposizione le istruzioni per il caricamento dei dati di RNA-Seq ai server pubblici come la sequenza Leggi Archive (SRA) su NCBI ( http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) per renderlo liberamente accessibile alla comunità scientifica. Nel complesso, prevediamo che questo articolo vi fornirà informazioni complete e sufficienti per biologi vite senza fine che intraprendono esperimenti di RNA-Seq per la prima volta così come gli utenti che eseguono frequenti un piccolo numero di campioni.