De geïnhaleerd worden beschreven kunnen genereren, monster voor karakterisatie en uniform een geneesmiddel aërosol in de longen van knaagdieren deponeren. Hierdoor kan de preklinische bepaling van de effectiviteit en veiligheid van geneesmiddeldoseringen afgezet in de longen; belangrijke gegevens op grond waarvan de klinische geïnhaleerde ontwikkeling van geneesmiddelen.
Respiratoire aandoeningen zoals astma en chronische obstructieve longziekte (COPD) worden momenteel behandeld met geïnhaleerde anti-inflammatoire en bronchusverwijdende middelen. Ondanks de beschikbaarheid van meerdere behandelingen, zijn beide ziekten groeiende zorg voor de volksgezondheid. De meeste astmapatiënten zijn goed gereguleerd huidige inhalatietherapieën maar een aanzienlijk aantal patiënten met ernstige astma niet. Astma treft naar schatting 300 miljoen mensen wereldwijd en ongeveer 20 procent een ernstige vorm van de ziekte. In tegenstelling tot astma, zijn er weinig effectieve therapieën voor COPD. Naar schatting 10% van de bevolking heeft COPD en de trend van het sterftecijfer neemt toe voor COPD terwijl het verminderen van andere ernstige ziekten. Hoewel de ontwikkeling van medicijnen voor inhalatie levering uitdaging, de neus alleen inhaleereenheid maakt directe afgifte van nieuwe geneesmiddelen voor de longen van knaagdieren voor pre-klinische effectiviteit en veiligheid / toxicologische studies. Geïnhaleerde toediening van geneesmiddelenheeft meerdere voordelen ademhalingsziekten, waarbij hoge concentraties in de longen verbetert werkzaamheid en minimale systemische bijwerkingen. Inhalatiecorticosteroïden en luchtwegverwijders profiteren van deze voordelen en ingeademd levering kan ook mogelijkheden voor toekomstige biologische therapieën te houden. De geïnhaleerd worden beschreven kunnen genereren, monster voor karakterisatie en uniform een geneesmiddel aërosol in de longen van knaagdieren deponeren. Hierdoor kan de pre-klinische bepaling van de effectiviteit en veiligheid van drug doses afgezet in de longen van knaagdieren, de belangrijkste gegevens die nodig zijn voor het starten van klinische ontwikkeling.
Er zijn veel voordelen aan het geïnhaleerde toediening van geneesmiddelen voor de behandeling van respiratoire aandoeningen. Geïnhaleerde levering geldt het therapeutische middel rechtstreeks naar de site van de actie, de longen. Een hoge lokale concentratie van het geneesmiddel in de longen heeft een groot voordeel dat dosis en systemische blootstelling minimaliseren, en maximaliseert werkzaamheid. Dit is een belangrijk voordeel, dat sterk de therapeutische index kan verhogen (TI, verhouding van de dosis geneesmiddel die een neveneffect op de dosis geneesmiddel die effectiviteit verschaft veroorzaakt) van een geneesmiddel. Inhalatie β 2-adrenerge agonisten, corticosteroïden en anti-cholinerge geneesmiddelen zijn effectief in het verbeteren van de longfunctie bij astma en COPD bewezen tegen zo laag mogelijke systemische bijwerkingen (tachycardie, immunosuppressie en constipatie) waargenomen wanneer deze geneesmiddelen oraal worden ingenomen. Nieuwe drug klassen (bijvoorbeeld PDE4 remmers 1 en BTK remmers 2) hebben onlangsbewezen effectief te verbeteren longfunctie bij preklinische dierziektemodellen maar vergelijkbaar met 2 agonisten, corticosteroïden en anti-cholinerge geneesmiddelen P lijden aan systemische bijwerkingen die kunnen worden geminimaliseerd door geïnhaleerde afgifte. Als gevolg van de extra kosten van de ontwikkeling van geïnhaleerd versus orale geneesmiddelen, moet een inhalatie formulering alleen in aanmerking voor respiratoire indicaties na een succesvolle orale / systemische toediening onthult dosis-limiterende mechanisme gebaseerde systemische bijwerkingen.
Preklinisch worden ingeademd verbindingen geoptimaliseerd om de TI, hetwelk in vivo werkzaamheid en bijwerkingen nemen toe. Aanvankelijk waren deze metingen kunnen worden uitgevoerd in afzonderlijke assays, gewoonlijk een topisch afgeleverd effectiviteit meten en systemisch afgeleverd neveneffect meten, maar echt vergelijken stoffen dient werkzaamheid en bijwerkingen worden gemeten op dezelfde dieren na toediening door inhalatie. Dit vereist dosis / respons studies die achieve genoeg verbinding toegediend aan de longen van een meetbare neveneffect te induceren. De enige manier nog gelijkmatig verdelen grote doses geneesmiddel in de longen van meerdere kleine dieren tegelijk is de neus slechts inhalatie 3, 4, 5. De sterke en zwakke punten van de verschillende inhalatieblootstelling technieken zijn recent beoordeeld 6, 7, 8. Gespecialiseerde apparatuur en een grote hoeveelheid testverbinding (een gram) vereist voor de neus alleen geïnhaleerde afgifte van geneesmiddelen, maar proof-of-concept studies mogelijk zijn met andere middelen.
Wanneer de hoeveelheid geneesmiddel is beperkt (mg hoeveelheden), directe toedieningsmethoden zijn optioneel maar lijdt aan niet-homogene afzetting, meer geneesmiddel geconcentreerd langs de centrale luchtwegen en minder goed vertegenwoordigd in de parenchymale / alveolairegebieden 3, 4, 5. De effectieve dosis door directe instillatie geleverd is altijd hoger en kan nooit rechtstreeks worden vergeleken met geïnhaleerde doses 4. Directe instillatie werkwijzen waaronder intranasale 9, intratracheale vloeistof 10, 11 en nevel instillatie 12, of droog poeder insufflatie 13, 14 kan worden gebruikt als een screeningsgereedschap bij benadering dosisbereik voor latere neus alleen inhalatieonderzoek bepalen of het bepalen Classificatie van effectiviteit / toxiciteit in een reeks structureel vergelijkbare middelen 15. Door de centrale luchtwegen depositiepatroon kan directe toediening werkwijzen nuttiger zijn om de effecten van verbindingen die werken op het centrale luchtwegen (bronchodilatatoren of mestcel remmers) dan i bepalenn de perifere long (ontstekingsremmers).
In tegenstelling tot mensen, die een aanzienlijke dosis geconcentreerd aerosol kan inhaleren uit een inhaleerinrichting in één adem continue productie van een inadembaar (0,5-5 urn massamediane aerodynamische diameter MMAD) aerosol, gedurende maximaal een uur nodig te deponeren een werkzame dosis geneesmiddel in de longen van spontaan ademende knaagdier in een neus alleen inhaleersysteem 16. Aërosols (jet vernevelaar of Wright stof toevoer 17) continu de vereiste grootte aerosol deeltjesgrootte en concentratie neus alleen inhalatiestudies kan produceren niet erg efficiënt in het genereren van hoge kwaliteit (inadembaar) aerosolen. Het geneesmiddel toevoersnelheden deze aerosolgenerators voor potent (IC50 pM tot nM in functionele testen op celbasis) verbindingen zijn algemeen bekend in het 1-10 mg / minuut en gewoonlijk minder dan 1% van dat farmaceutische aerosol maakt de ademzone van de dieren(Figuur 1). Veel van de deeltjes gegenereerd zijn te groot (> 5 pm) waardoor de longen binnendringen en worden verwijderd door een aërosol classifier (a pre-afscheider of cycloon met een 5 urn snijpunt) een grote dosis geneesmiddel in de neus te voorkomen. Het toevoegen aan de inefficiëntie van de neus slechts inhalatiesystemen is de kleine deeltjesgrootte (0,5-5 pm MMAD) voor inadembare deeltjes. Veel van de aërosoldeeltjes kleiner dan 0,5 urn uitgeademd (sigarettenrook) en niet in de longen 18 afgezet. Ook veel van de "grotere" aërosoldeeltjes (~ 5 pm) storting in de neus worden opgevangen of mucociliaire klaring getransporteerd naar de achterkant van de keel wanneer ze worden ingeslikt in de maag 19. Bij gebruik neus alleen inhalatie, de neergeslagen in de neus dosis is altijd groter dan de afgezette dosis in de longen en nasale dosering kan bijdragen aan systemische blootstelling en neveneffecten 20. Inherent, ingeademd drug doses klein zijn (in het bereik microgram) het minimaliseren van systemische bijwerking potentieel geneesmiddel geabsorbeerd door de nasale, long-, maag- of weefsels. Zelfs wanneer de deeltjesgrootte van de dieren geleverde aerosol in het ingeademd, gemiddeld slechts 4% van de aerosol deeltjes die het naar de ademzone van het depot dieren in de longen. Efficiëntere aërosols verkrijgbaar, maar de jet vernevelaar en Wright stof diervoeder ongeëvenaard voor hun vermogen om continu aërosolen uit diverse vloeibare en droge poederformuleringen resp.
Inhaleerbare aerosol uit de pre-separator overgaat in de neus alleen inhalatieblootstelling eenheid 21 die is gebaseerd op een stroming langs de neus 22 ontwerp. De inhaleereenheid over 3 lagen (twee lagen worden getoond in Figuur 1) en bevat elke etage 10 blootstelling poorten voor dieren en aerosol bemonstering. De poorten zijn omtrek rondom het central aerosol plenum. Bewuste muizen worden in glazen tegenhoudende houders (6 inch lang en 1,2 inch diameter) en adem de aerosol inhoud van de geïnhaleerd worden. De muizen zijn niet gewend aan de beveiligingssystemen 23. Uit ervaring is gebleken dat muizen verdragen buis beperking van minder dan een duur die gelijk uur, met of zonder aanpassing 2.
De inhalatie apparaat is ontworpen om geneesmiddel aerosols rechtstreeks aan de longen van de dieren, terwijl voorkomen doordat de operators. De potentie / toxiciteit van deze drugs is meestal onbekend en meerdere safety engineering controles worden gebruikt om de blootstelling aan de exploitanten te voorkomen. De exploitanten moeten altijd dragen persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratorium jassen, maskers, en een veiligheidsbril). De externe kamer van de inhaleereenheid onder negatieve druk te allen tijde tijdens bedrijf waardoor de veilige verwijdering van enkele of groepen dieren without afsluiten van de aërosolgenerator. De inhaleereenheid is ook opgenomen in een secundaire ruimte een onderdruk gehandhaafd door een uitlaatpoort in het plafond om het ontsnappen van aerosol in de kamer bij storingen te voorkomen. Alle effluent lucht uit het inhaleren wordt gefilterd door een HEPA-filter voordat ze in het milieu. De neus-only exposure systeem dat wordt gebruikt in dit manuscript werd gekocht van een enkele leverancier (zie aanvullende Table of Materials).
Een neus alleen inhalatie installatie en de werking op farmaceutische aërosolen leveren aan de longen van knaagdieren is beschreven. Fixeren van dieren in de neus alleen houders is een gewoonlijk gebruikte methode voor dieren blootgesteld aan lucht materiaal. Een experiment werd uitgevoerd waaruit de anticholinergische bronchodilatator ipratropiumbromide 34 kan potente reverse methacholine bronchoconstrictie bij door neus- alleen inhalatie geleverd aan muizen met een ED50 van 0,1 ug / kg dosis afgezet. Een meer dan 10-voudige toename van de effectieve dosis van ipratropium nodig was voor bronchodilatatie na intratracheale afgifte (ED50 intratracheale = 1,3 ug / kg, gegevens niet getoond) leveren. Dit is te wijten aan de niet-homogene depositiepatroon geneesmiddel in de longen door intratracheale dosering 3, 5, 10. 10 maal en meer effectieve dosisverschillen tussen inhalatie en intratracheale dosering technieken voor andere geneesmiddelen zijn eerder waargenomen door anderen 4.
De niet-homogene depositiepatroon geneesmiddel in de longen door intratracheale toediening vertraagt ook geneesmiddel absorptie door de longen 35, verlagen van de snelheid waarmee het geneesmiddel komt in de systemische circulatie en het verminderen van de kans om er systemische bijwerkingen. Daarom de veiligheid / werkzaamheid (therapeutische index) van 36 nieuwe geïnhaleerde geneesmiddelen te optimaliseren, dient de neus slechts inhalatieaflevering gebruikt. Intratracheale depositie een onnauwkeurige schatting van de TI geven door het genereren abusievelijk hoge effectieve doses in de long en lage doses aan de systemische circulatie.
Als nieuwe geneesmiddelen per inhalatie geleverd worden ontwikkeld, is het essentieel om adequaat te vertalen van de werkzame dosis geneesmiddel uit preklinische studies naar de werkzaamheid van een ef voorspellenficacious humane dosis voor klinische proeven. De beruchte dood van Tusko de olifant 37 wordt vaak aangehaald in de literatuur om ons te herinneren aan allometrische scaling gebruiken om interspecies drug doses voorspellen en dat interspecies drug doses niet lineair worden geëxtrapoleerd op basis van een eenvoudige vergelijking van het lichaam massa. Het is gebruikelijk om een allometrische aanpak gebruiken met een allometrische exponent b van 0,67 voor de menselijke drug doses voorspellen van preklinische studies naar de werkzaamheid 38. Met de muis geïnhaleerde ED90 van 0,9 ug / kg voor ipratropium, een allometrische exponent van 0,67, een muislichaam gewicht van 0,03 kg en een menselijk lichaamsgewicht van 60 kg; schatting menselijke ED90 van 0,07 ug / kg ((0,9 * (0.03 / 60) (1-0,67) = 0,07) kan worden berekend als de voorspelde menselijke afgezette dosis Aanbevolen muisdata. De voorspelde waarde is vergelijkbaar met de werkelijke menselijke werkzame afgezette dosis van 0,26 ug / kg, die kan worden berekend uit de geleverdese van 40 ug 39 gedeeld door het menselijk lichaamsgewicht van 60 kg vermenigvuldigd met een humane orale inhalatie pulmonaire depositie fractie 16 van 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Een schatting van de effectieve menselijke geïnhaleerde gedeponeerd dosis helpt ook om de geleverde doses gebruikt in inhalatie toxicologische studies die nodig zijn voor klinische proeven 40 plannen.
Gespecialiseerde materialen grote hoeveelheid testverbinding (een gram) nodig voor de neus met alleen inhalatie geneesmiddelafgifte kunnen aanzienlijke beperkingen zijn bij de ontwikkeling van de neus alleen inhalatietechniek. Een ijkprocedure zonder aanwezige dieren is nodig als een speciale dosis is nodig om een (meestal toxicologie en geen werkzaamheid dosis / respons) studie en deze ijkprocedure meer geneesmiddel nodig beschikbaar zijn. Deze kalibratie run is noodzakelijk omdat de fysisch-chemische eigenschappen van elk geneesmiddel / formulering hebben een grote invloed op de afgezette dosis kan variërenvan het geneesmiddel in de longen. Optimalisatie van de lucht en drugs voedingssnelheden naar de aërosolgenerator gedurende de ijkprocedure nodig is om een aerosol deeltjesgrootte en de concentratie van het specifieke vereiste dosis te bereiken. Terwijl de aërosolgenerator lucht en drugs toevoersnelheden bij de werkwijzen voorgesteld een redelijk uitgangspunt, is er potentieel dat voor een bepaalde geneesmiddelformulering een niet-inadembare (deeltjesgrootte> 5 mm) aerosol gegenereerd. Op de preklinische fase, is er vaak niet genoeg drug beschikbaar voor een kalibratie-run te doen en het is onmogelijk om a priori wat doses (indien aanwezig) krijgen in de longen te leren kennen. Ook wordt statische elektriciteit tijdens het generatieproces aerosol en kan de tijd die het aerosol-concentratie in evenwicht beïnvloeden. Het is belangrijk om een goede aarding van de apparatuur om statische lading te minimaliseren. Een andere mogelijkheid om statische elektriciteit te minimaliseren is het vocht toe te voegen aan de aan de inhalatie unit toegevoerde lucht, om de geleidbaarheid te verhogen enverdrijven elektrostatische ladingen op deeltjes 25. Bevochtiging van de naar de aërosolgenerator toegevoerde lucht niet vereist voor dierlijke comfort tijdens korte (<1 uur) doseringssessies maar moet worden beschouwd als langere behandelingsperiode keer worden gebruikt.
Geneesmiddelen kunnen worden afgegeven aan de longen van dieren door passieve neus alleen inhalatie of rechtstreekse intratracheale toediening methoden nasofaryngeale depositie omzeilen. Neus alleen inhalatieaflevering wordt algemeen gebruikt op het gebied van inhalatie toxicologie 41 maar spaarzaam vroeg in het ontdekkingsproces van geneesmiddelen gebruikt. Een multidisciplinair onderzoeksteam is nodig voor het uitvoeren van de neus-only inhalatie studies te wijten aan de: behoefte aan grote hoeveelheden drugs, gespecialiseerde kennis die nodig is om te formuleren, het genereren en karakteriseren van aërosolen; werken complexe apparatuur, en meet drug werkzaamheid in diermodellen van luchtwegaandoeningen. De levering hierin beschreven technieken worden gebruikt om de ontwikkeling small molecule geïnhaleerde geneesmiddelen maar in de toekomst kunnen worden toegepast op geïnhaleerde biologische 42 ontwikkelen 43. Hopelijk zal de procedures en tips die in dit manuscript zal nieuwe pre-klinische drug discovery en toxicologie onderzoekers om de vaardigheden die nodig zijn om drugs te leveren aan knaagdieren door aerosolinhalatie verwerven vergemakkelijken.
The authors have nothing to disclose.
Wij erkennen: Dr. Thomas Budiman op TSE Systems GmbH voor zijn technische expertise en apparatuur aanpassen. John Fry (Battelle Inc.) en Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) voor hun behulpzaam discussies. Tian Wu, Sam Mboggo april Miller, en Sean Davis (Amgen) voor hulp bij de experimenten.
Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |