Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)
概要
precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.
Abstract
Há uma demanda crescente para analisar muitas amostras biológicas para a compreensão da doença e descoberta de biomarcadores. estratégias de proteômica quantitativas que permitem a medição simultânea de múltiplas amostras tornaram-se generalizada e reduzir consideravelmente os custos experimentais e tempos. O nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada precursor combinado marcação isotópica e etiquetagem isobárica (cPILOT), que aumenta a amostra multiplexagem de marcação isotópica tradicional ou abordagens de marcação isobáricas. cPILOT global pode ser aplicada a amostras provenientes de células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros e dá informação sobre a abundância relativa de proteína em diferentes condições de amostra. cPILOT funciona por 1) usando condições de baixa tampão de pH para selectivamente péptido dimethylate terminais N e 2) utilizando condições de tampão de pH elevado para rotular aminas primárias de resíduos de lisina com reagentes isobáricas comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais / Reagentes). O grau demultiplexagem amostra disponível é dependente do número de etiquetas precursor utilizado e o reagente de marcação isobárica. Aqui, apresentam-se uma análise de 12-Plex utilizando luz e dimetilação pesada combinada com reagentes isobáricas seis-plex para analisar 12 amostras de tecidos de rato em uma única análise. multiplexagem aumentada é útil para reduzir o tempo e custo experimental e mais importante ainda, permitindo a comparação entre muitas condições de amostra (réplicas biológicas, estágio da doença, tratamentos medicamentosos, genótipos, ou pontos de tempo longitudinais) com polarização menos experimental e erro. Neste trabalho, a abordagem cPILOT global é utilizado para analisar o cérebro, coração e tecidos do fígado em todo repetições biológicas dos controles modelo do rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. CPILOT global pode ser aplicada ao estudo de outros processos biológicos e adaptada para aumentar a multiplexagem amostra para maior do que 20 amostras.
Introduction
Proteomics muitas vezes envolve a análise de muitas amostras utilizadas para melhor compreender os processos de doença, de cinética enzimática, modificações pós-traducionais, resposta a estímulos ambientais, de resposta a tratamentos terapêuticos, a descoberta de biomarcadores, ou mecanismos de drogas. Os métodos quantitativos podem ser utilizados para medir as diferenças relativas nos níveis de proteína através das amostras e pode ser livre de marcador ou envolver a marcação isotópica (metabólica, químicos, ou enzimáticos). Os métodos de marcação de isótopos estáveis têm crescido em popularidade, porque eles permitem muitas amostras a ser analisadas simultaneamente e são adequados para as amostras a partir de diferentes células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros. Marcação isotópica métodos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, aumentar o rendimento experimentalenquanto reduz o tempo de aquisição, custos e erro experimental. Estes métodos usam espectros de massa precursor para medir a abundância relativa de proteínas a partir de picos peptídicos. Em contraste, os reagentes de marcação isobáricas 8, 9, 10 gerar is repter que, ou são detectadas em MS / MS ou MS 3 11 e espectros estes picos são usados para informar sobre abundâncias relativas das proteínas.
O atual estado-da-arte no multiplexagem proteómica ou é uma análise de marcação isobárica 10-Plex 12 ou 12-Plex 13. Multiplexagem amostra melhorada (isto é,> 10 amostras) os métodos têm sido desenvolvidos pelo nosso laboratório para os tecidos 14, 15, 16, 17, e por outro para a análise de células 18 </sup>, 19, 20, 21 tecidos, ou péptidos segmentados 22. Desenvolvemos uma técnica de multiplexagem reforçada chamado precursor de marcação isotópica combinado com marcação isobárica (cPILOT). CPILOT global é útil para a obtenção de informações sobre as concentrações relativas de todas as proteínas em diferentes condições de amostra (≥12) 14. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral cPILOT. Peptídeos trípticos ou Lys-C são selectivamente marcado na extremidade N-terminal com dimetilao usando baixo pH 2 e nos resuos de lisina com 6-Plex reagentes usando pH elevado. Esta estratégia dobra o número de amostras que podem ser analisadas com os reagentes isobáricas que ajuda a reduzir os custos experimentais e, adicionalmente, reduz passos experimentais e tempo.
cPILOT é flexível como nós desenvolvemos outros métodos para estudar modi oxidativo pós-translacionalções, incluindo as proteínas de 3-nitrotirosina modificado 14 e péptidos contendo cisteina, com S-nitrosilação (oxcyscPILOT) 23. Também desenvolvemos um aminoácido abordagem selectiva, cPILOT cisteína (cyscPILOT) 17. MS 3 aquisição com uma parte superior de iões de 11 ou selectiva-y 1 -Permutadores método 15 pode ajudar a reduzir a interferência de iões repórter e melhorar a exactidão quantitativa de cPILOT. O uso de MS no 3 o método de aquisição requer um instrumento de alta resolução com um analisador de massa Orbitrap apesar dos instrumentos de armadilha de iões de baixa resolução, podem também trabalhar 24.
Anteriormente, cPILOT tem sido usado para estudar proteínas hepáticas 16 de rato modelo da doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos como realizar análise cPILOT mundial usando cérebro, coração e homogeneizados de fígado para estudar o papel do periphery na doença de Alzheimer. Esta experiência incorpora replicação biológica. Devido à versatilidade de cPILOT, os usuários interessados podem usar a técnica para estudar outros tecidos para uma série de problemas e sistemas biológicos.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT permite a medição simultânea de mais do que 12 amostras originais. A fim de assegurar a etiquetagem bem sucedido em ambos os resíduos do N-terminal e lisina de péptidos, é imperativo ter o pH correcto para cada conjunto de reacções e para executar a primeira reacção dimetilao para rotulagem péptido. dimetilao selectiva na extremidade N-terminal é realizada por ter um pH em ~ 2,5 (± 0,2). Isto é conseguido através da exploração das diferenças de pKa de um dos grupos amino de lisina e o N-terminus…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem a Universidade de Pittsburgh start-up fundos e NIH, concessão NIGMS R01 (GM 117191-01) para RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
参考文献
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