Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)
概要
Gecombineerd voorloper isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT) is een kwantitatieve proteomics strategie die steekproef multiplexing mogelijkheden van isobarisch labels verbetert. Dit protocol beschrijft de toepassing van cPILOT op weefsels van de ziekte van Alzheimer muismodel en wildtype controles.
Abstract
Er is een toenemende vraag naar vele biologische monsters analyseren voor de ziekte van begrip en het ontdekken van biomarkers. Kwantitatieve proteomics strategieën waarmee gelijktijdige meting van meerdere monsters zijn wijdverspreid en experimentele kosten en tijd sterk verminderen. Ons laboratorium ontwikkelde een techniek genaamd gecombineerde precursor isotopische labeling en isobare tagging (cPILOT), welk monster multiplexen van traditionele isotopische labeling of isobare tagging benadering verbetert. Global cPILOT kan worden toegepast op monsters afkomstig uit cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen en geeft informatie over de relatieve abundanties eiwit in verschillende monstercondities. cPILOT werkt door 1) het gebruik van lage pH buffer condities selectief dimethylate peptide N-termini en 2) met behulp van hoge pH buffer omstandigheden primaire aminen lysineresiduen labelen met commercieel verkrijgbare reagentia isobare (zie Tabel Materialen / Reagentia). De mate vansample multiplexen verkrijgbaar is afhankelijk van het aantal gebruikte etiketten precursor en isobare tagging reagens. Hier presenteren we een 12-plex analyse die lichte en zware dimethylering gecombineerd met zes-plex isobare reagentia om 12 monsters van muizenweefsels analyseren één analyse. Verbeterde multiplexing is nuttig voor experimentele tijd en kosten en nog belangrijker verminderen, waardoor vergelijking tussen verschillende monstercondities (biologische replicaten, ziektestadium, drugs, genotypen, of longitudinale tijdstippen) met minder experimentele vertekeningen en fouten. In dit werk wordt de globale cPILOT aanpak waarbij de hersenen, het hart en de lever weefsels door biologische replica's te analyseren vanuit een ziekte van Alzheimer muismodel en wild-type controles. Global cPILOT kan worden toegepast op andere biologische processen te bestuderen en ingericht om sample multiplexen stijgen tot meer dan 20 monsters.
Introduction
Proteomics gaat vaak gepaard met de analyse van vele monsters gebruikt om ziekteprocessen beter te begrijpen, enzymkinetiek, post-translationele modificaties, als reactie op prikkels uit de omgeving, als reactie op therapeutische behandelingen, de ontdekking van biomarkers of drug mechanismen. Kwantitatieve werkwijzen kunnen worden toegepast voor verschillen in relatieve eiwitniveaus in de monsters te meten en kan labelvrije blijkt of isotopische labeling (metabolische, chemisch of enzymatisch). Stabiele isotopen methoden zijn gegroeid in populariteit omdat ze laten veel monsters tegelijkertijd te analyseren en zijn geschikt voor monsters uit verschillende cellen, weefsels, lichaamsvloeistoffen of hele organismen. Isotopen werkwijzen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 toename experimentele doorvoerterwijl het verminderen van acquisitie tijd, kosten en experimentele fout. Deze methoden gebruiken precursor massaspectra relatieve abundanties van eiwitten uit peptidepieken meten. Daarentegen isobare tagging reagentia 8, 9, 10 genereren reporter ionen die ofwel gedetecteerd in MS / MS en MS3 spectra en 11 deze pieken worden gebruikt voor het rapporteren van de relatieve abundanties van eiwitten.
De huidige stand van de techniek in proteomics multiplexing ofwel een 10-plex 12 of 12-plex isobare tag analyse 13. Verbeterde monster multiplexing (dwz> 10 monsters) methoden ontwikkeld door ons laboratorium voor weefsels 14, 15, 16, 17 en anderen voor de analyse van cellen 18 </sup>, 19, 20, 21 weefsels of gerichte peptiden 22. We ontwikkelden een verbeterde multiplexing techniek genaamd gecombineerd voorloper isotopische labeling met isobare tagging (cPILOT). Global cPILOT is nuttig om informatie over de relatieve concentraties van eiwitten in verschillende monstercondities (≥12) 14. Figuur 1 toont een algemene werkstroom cPILOT. Tryptische of Lys-C peptiden selectief gelabeld aan de N-terminus met behulp dimethylering lage pH 2 en lysineresten met 6-plex reagentia met behulp van hoge pH. Deze strategie verdubbelt het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd isobare reagentia die helpt om experimentele kosten en bovendien verminderen, vermindert experimentele werk en tijd.
cPILOT is flexibel als we andere methoden hebben ontwikkeld om oxidatieve post-translationele modi te bestuderencaties, waaronder 3-nitrotyrosine gemodificeerde eiwitten 14 en cysteïne bevattende peptiden met S-nitrosylation (oxcyscPILOT) 23. We hebben ook een aminozuur selectieve aanpak, cysteïne cPILOT (cyscPILOT) 17. MS3 verkrijgen met een top-ion 11 of selectief y 1 -ion werkwijze 15 kan helpen verminderen reporter ion interferentie en verbetering kwantitatieve nauwkeurigheid van cPILOT. Het gebruik van MS3 in het verwerven werkwijze vereist een hoge-resolutie welks orbitrap massa-analysator hoewel lage resolutie iontrap instrumenten mogelijk ook 24.
Eerder heeft cPILOT is gebruikt om de lever eiwitten 16 studeren aan de ziekte van muismodel van Alzheimer. Hier beschrijven we hoe de wereldwijde cPILOT analyses uit te voeren met behulp van de hersenen, hart en homogenaten lever naar de rol van de randapparatuur, te bestuderenry bij de ziekte van Alzheimer. Dit experiment omvat biologische replicatie. Vanwege de veelzijdigheid van cPILOT, kunnen geïnteresseerde gebruikers van de techniek gebruiken om andere weefsels te studeren voor een scala aan biologische problemen en systemen.
Protocol
Representative Results
Discussion
cPILOT voorziet in de gelijktijdige meting van meer dan 12 unieke monsters. Om succesvol tagging zowel de N-terminus en lysine resten van peptiden te verzekeren, is het noodzakelijk om de juiste pH voor elke set reacties en om de dimethylering eerste reactie uit te voeren voor peptide labeling. Selectieve dimethylatie op de N-terminus wordt uitgevoerd door een pH op ~ 2,5 (± 0,2). Dit wordt bereikt door het benutten van de verschillen van de pKa van de aminogroepen van lysine en N-terminus. Bij pH 2,5, lysine inactief …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de Universiteit van Pittsburgh Start-up fondsen en NIH, NIGMS R01 subsidie (GM 117.191-01) naar RASR.
Materials
| Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
| Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
| Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
| Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
| Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
| BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Urea | Biorad | 161-0731 | |
| Tris | Biorad | 161-0716 | |
| Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
| L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
| Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
| Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13 C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
| Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
| Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
| Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit | Protea BioSciences | SP-155-24kit | |
| Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
| Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) – 6 reactions (1 x 0.8 mg) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
| Standard vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | any mixer can be used |
| Oasis HLB 1cc (10 mg) extraction cartridges | Waters | 186000383 | These are C18 cartridges |
| Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model | Sigma Aldrich | 57265 | A 12 port model is also sufficient |
| Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac is sufficient |
| Water bath chamber | Thermo Scientific | 2825/2826 | Any brand of a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient. |
| Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Eksigent Nano LC – Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler | Sciex | – | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. |
| LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | – | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. |
| Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
| Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient. |
| pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a ph meter is sufficient |
| pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of ph buffer 10 is sufficient |
| pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand ph buffer 7 is sufficient |
| 1.5 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.6 mL eppendorf tubes, 500pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
| 0.65µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
| 2 mL microcentrifuge tubes, 72 units | Thermo Scientific | 69720 | |
| C18 packing material (5 µm, 100 Å) | Bruker | PM5/61100/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
| C18 packing material (5 µm, 200 Å) | Bruker | PM5/61200/000 | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient. |
参考文献
- Ong, S. -. E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Koehler, C. J., Arntzen, M. &. #. 2. 1. 6. ;., de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
- Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, . From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , (1998).
- Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
- Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
- Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
- Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
- Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
- Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
- Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
- Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
- Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS – Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
- Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
- Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2 (2012).
- Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
- Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
- Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
- Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
- Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer’s disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
- Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
- Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
- McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
