ביטוי ערוץ יון לשליטה באמצעות Transfection ועין מתנהל חלוף

Heterologously להביע מערכות היא אחת הטכניקות המקובלות ביותר ללמוד מספר רב של פונקציות הסלולר ^1. פרופיל חלבון אנדוגני הנמוך שלהם, דרישות תחזוקה מינימאליות, צמיחה אמינה, והיכולת תופסת ולהביע דנ"א זר הפכו שורות תאים כגון כליה העוברית האנושי (HEK293) וסינית אוגר שחלה (CHO) כמעט חיונית למחקר ביולוגי ^{2, 3.} תחומי מחקר באמצעות מערכות Heterologous כוללים חלבונים בממברנה, איתות תאית, ואת פעילות האנזימטית. בעקבות transfection של דנ"א זר לתוך התא, צורות שונות של ניתוח יכול להתבצע, לרבות אלקטרופיזיולוגיה, הדמיה סידן ratiometric, כתם המערבי, וכו ^{'4, 5.}

בשל המגוון הרחב של יישומים פוטנציאליים למערכות ביטוי Heterologous, differe רבריאגנטים ומוצרים NT פותחו לנצל תאים אלה והאיכויות שלהם ^-6. מערכות משלוח דנ"א זמני או לצמיתות לשלב דנ"א זר לתאים ללמוד חלבון אקסוגני הפך לאחד הכלים הפופולריים ביותר ושימושי למחקר ביולוגי. באופן ספציפי יותר, זמני DNA transfecting לתא נעשה שימוש נרחב כתהליך פשוט, ישר קדימה הדורש מעט זמן יחסית וחומרים. יתר על כן, שיעור תאי ההצלחה לעבור transfection הוא גבוה ^7. טכניקה זו היא מאוד אמינה כאשר הוא משולב עם גן סמן כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), וניתן להשתמש בו עבור טכניקות שונות כגון הדמית סידן אלקטרופיזיולוגיה ^5. למרבה הצער, אם כי, זמני להביע דנ"א לתוך תאי מארחים מגיע עם כמה מלכודות גדולות, לא כהוא זה כי רמת הביטוי לכל תא אינה מהימנה. מספר העותקים של ה- DNA פלסמיד נלקח up לכל תא הוא בלתי נשלט, ולכן הביטוי בין ניסויים בודדים יכול להשתנות במידה רבה ^2. סוגיה זו מקבלת משמעותי כאשר אחד מנסה לשכפל מצבים פיזיולוגיים, או ביצוע טכניקות אוסף נתונים מדויקים.

כפתרון הסיבוכים הנ"ל, פרוטוקולי transfection יציבים עוצבו שבו גן של עניין יכול להיות מוכנס לתוך הגנום של תא תחת הפיקוח ההדוק של אמרגן מושרה, כגון מערכת ביטוי המדכא טטרציקלין, הבטחה יחידה עותק של פלסמיד משתלב בגנום של כל תא ובא לידי ביטוי רק לאחר גיוס של מנגנון שעתוק, למשל, בנוכחות דוקסיציקלין. אמנם זה פותר את המכשולים של רמות ביטוי חלבון עולות בקנה אחד, שיטה זו מאבדת את הנוחות של פרוטוקול מהיר ויחסית פשוט של transfections חולף. הקמת קו תאים יציבות לוקח לפחות כמה שבועות which יש לכייל עקומת הרג שקבע אנטיביוטיקה ספציפית כדי לשמור על ביטוי החלבון ולהבטיח שילוב של וקטור ובמיומנות לבחור ולגדול מושבות תאים. בסך הכל זה לוקח הרבה יותר זמן ומאמץ עם שיעור הצלחה נמוך ^8.

הנה, אנחנו מציגים פרוטוקול ביניים שמושך על נקודות החוזק של שתי אפשרויות transfection הפופולריות לספק דרך פשוטה ויעילה לשלוט ברמות ביטוי בכל שורת תאים מושרה. תוך שמירת תאים עם מערכת ט מושרה, אנו transfect הגן שלנו זמני של עניין, ערוץ קטיון פוטנציאל חלוף קולטן V subfamily חבר 1 (TRPV1), ligated לתוך וקטור כי ניתן לשלב homologously עם המערכת המדכאת. בדרך זו, הגן יכול להיות מוחדר לתאים ללא מתחילים להביע. רק עם התוספת של דוקסיציקלין אין הגן מתחיל להביע, מה שמאפשר לנו לכייל את רמות expr החלבוןession פי הטכניקה או הרמות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים. הפרוטוקול שלנו גם ימנע סיבוכים ארוכים לפריסת יצירת קו תא להביע ביציבות. אנחנו מתחילים על ידי הצגת הרמות המשתנות של הפעלת TRPV1 בתחום הדמית סידן בלתי להתהוות מתוך ארבע שעות של אינדוקציה ואיך עליית רמות סידן תאי בקורלציה. לאחר מכן, אנו לשכפל את פרוטוקול בתצורת התא כולו של הטכניקה מהדק תיקון, מראה הזרם הגובר עם הגדלת זמן של אינדוקציה. לבסוף, אנו מציגים דוגמאות של קלטות אלקטרופיזיולוגיה ערוץ אחד, ונראה כי טכניקה זו שימושית במיוחד עבור ביטוי מבוקר כאשר מחפשים אוסף נתונים מדויק על בסיס של יחידת פרט של החלבון. באמצעות הפרוטוקול שלנו, אנו מציעים דרך נוחה לשלוט ביטוי חלבון במערכות Heterologous תוך הימנעות סיבוכי תרבית תאים ממושכים, ובכך לספק דרך לשלוט בתנאים בין ניסויים ולספק מומחדש תוצאות לשכפול.