誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

異種システムを発現する細胞機能¹の多数を研究するために最も広く使用されている技術の一つです。それらの低い内因性のタンパク質プロフィール、最小限のメンテナンス要件、信頼性の高い成長、および外来DNAを取り込み、表現する能力は、ヒト胚性腎臓（HEK293）および生物学的研究^2、3にほぼ不可欠なチャイニーズハムスター卵巣（CHO）などの細胞株を作りました。異種のシステムを用いた研究の分野は、膜タンパク質、細胞内シグナル伝達、酵素活性を含みます。細胞への外来DNAのトランスフェクションに続いて、分析の多くの異なる形態は、電気生理学、レシオメトリックカルシウムイメージング、ウェスタンブロット、 等 ^4、5を含む、実施することができます。

異種発現系のための潜在的なアプリケーションの広い配列に、多くのdiffereによる塩基試薬および生成物は、これらの細胞及びそれらの品質^6を利用するために開発されています。一過性または恒久的に外因性タンパク質を研究するために、細胞に外来DNAを組み込み、DNAの送達システムは、生物学的研究のための最も人気のあると便利なツールの一つとなっています。具体的には、細胞内に一過性にトランスフェクトするDNAが広く、比較的少しの時間と材料を必要とする単純な、まっすぐ進むプロセスとして使用されています。さらに、トランスフェクションを受けた細胞の成功率は^、7高いです。この技術は、緑色蛍光タンパク質（GFP）などのマーカー遺伝子と組み合わせたときに非常に信頼性があり、このようなカルシウムイメージングおよび電気生理学⁵のような多くの異なる技術のために使用することができます。しかし、残念ながら、一過性DNAを宿主細胞に発現していない細胞あたりの発現レベルの信頼性が低いこと以上に、いくつかの主要な落とし穴が付属しています。プラスミドDNAのコピー数は、Uをとっセル当たりのpは、このように個々の実験間での発現が大幅に^2を変えることができ、制御不能です。いずれかの生理学的条件を再現しようとしている、または正確なデータ収集技術を実行すると、この問題が顕著になります。

上記の合併症を解決するように、安定なトランスフェクションプロトコルは、単一のを確実に、テトラサイクリンリプレッサーの発現系として、目的の遺伝子が誘導性プロモーターの厳格なコントロール下で細胞のゲノムに挿入することができるように設計されていますプラスミドのコピーは各細胞のゲノムに組み込まれ、ドキシサイクリンの存在下で、例えば、転写機構の誘導後にのみ発現されます。これは、一貫性のないタンパク質の発現レベルの障害を解決するが、この方法は、一過性トランスフェクションの迅速かつ比較的単純なプロトコルの利便性を失います。安定な細胞株を確立することはwhicで少なくとも数週間かかります時間1は、タンパク質の発現を維持し、ベクターの組み込みを確保し、巧みに選択して、細胞コロニーを成長させるために、特定の抗生物質によって設定された殺害曲線を校正しなければなりません。全体的にこれは、より低い成功率⁸と有意に多くの時間と労力を要します。

ここでは、任意の誘導性細胞株における発現レベルを制御するためのシンプルで効果的な方法を提供する人気のトランスフェクションのオプションの両方の強みを生かし、中間プロトコルを紹介します。誘導性のtetシステムで細胞を維持しながら、我々は、一過性相同リプレッサーシステムと組み合わせることができるベクターに連結関心の私達の遺伝子、一過性受容体電位陽イオンチャネルサブファミリーVメンバー1（TRPV1）を、トランスフェクション。この方法では、遺伝子が発現し始めずに細胞に導入することができます。唯一のドキシサイクリンを添加した遺伝子は、タンパク質exprのレベルを校正するために私たちにできるように、発現し始めるん生理学的条件下で観察された技術やレベルに応じてession。我々のプロトコルは、安定発現細胞株を生成するに関連付けられている長い合併症を回避することができます。私たちは、誘導および方法細胞内カルシウムレベルの上昇が相関の4時間を通じて非誘導からのカルシウムイメージングにおけるTRPV1の活性化の変化レベルを示すことから始めます。我々は次に、誘導時間の増加に伴って増加する電流を示し、パッチクランプ技術の全細胞構成でプロトコルを複製します。最後に、我々は、単一チャネルの電気生理学的記録の例を提示し、タンパク質の個々の単位に基づいて正確なデータ収集を探しているときに、この技術は、制御された発現のために特に有用であることを示しています。我々のプロトコルを介して、我々は、このように、実験の間に条件を制御し、MOを提供するための方法を提供し、長い細胞培養合併症を回避しながら、異種系におけるタンパク質の発現を制御するための便利な方法を提供します複製可能な結果を​​再度。