一种内在的弥漫性脑胶质瘤脑桥快速验尸细胞培养协议（DIPG）

该协议一直与我们同所有的病人数据的适当去鉴定机构审查委员会，并按照为人类福利的所有机构，国家和国际准则进行审批。获取与该协议的工作之前，所有适当的机构审查委员会的批准和知情同意从病人家属。 1.获得组织样本注：本协议的一个重要组成部分，要求组织捐赠在尸检时立即启动妥善处理。总体样本生存能力上尽量减少验尸间隔（PMI），立即组织转移到添加抗生素/抗真菌药合适的冷媒，在整个运输保持样品在湿冰，并在整个协议保持无菌技术显著依赖。 一旦通知即将捐赠，准备样品采集套件。使用装运箱与能够直接用于组织样品的返回运输隔热容器，包括下列物质： 包括无菌制剂材料，包括无菌手套，窗帘和手术刀。 包括8 – 包含在冰或冰袋冷敷隔热容器30毫升航运媒体10无菌50毫升锥形管。 注：虽然任何标准的细胞培养基能正常工作，与辅以抗生素/抗霉菌休眠-A获得了最好的样品生存能力。 包括其他分析（如固定剂），任何进一步的样品管。 如果尸检不会在调查的现场进行，包括文件，明确规定如何收集肿瘤样品。这包括详细信息，如从脑和延髓如涂保持无菌，保持在湿冰上样品管，并且包括样本铁道部细胞常侵入这些地区。 在验尸过程中保持无菌。考虑脑颅骨内消毒，这样遵守无菌技术（包括更换手套）一旦头盖骨是开放的。避免污染对皮肤和头发是至关重要的。 从解剖腹侧肿瘤（脑桥的“肚子”，见参考图1）。用无菌手术刀，切开从肿瘤小1厘米块，并立即转移到冷的航运媒体（参见1.1.2步注），并把湿冰。放置10毫升组织到每个管中，导致组织和介质中的40毫升每管的终体积。 注：在DIPG的情况下，肿瘤浸润弥漫桥脑，经常脑干的其余部分。因此，收集尽可能多的样品尽可能的，通常包括3 – 桥 – （40毫升组织30）和1 – 4管2管（10 – 20毫升组织）分别从脑和髓质。 收集SAM普莱斯从脑和延髓并列脑桥，常含有许多肿瘤细胞。 样品采集后，船在湿冰样品O / N在隔热容器。不出货干冰样本，因为冷冻会杀死细胞。 2.准备来样加工之前开始样品制备，消毒组织培养罩与刀片，弯曲的止血，以及任何其他非无菌工具沿着在UV光下进行1小时。执行所有在无菌条件下执行以下步骤，以防止培养物的污染。 准备和无菌过滤器解决方案。 以制备1.8M的蔗糖溶液中，溶解于蒸馏水300mL的308.07克蔗糖。加入50毫升10×Hank's缓冲盐溶液（HBSS）中不含钙或镁和使总体积用蒸馏水500毫升。保存在4℃。 为了准备酶消化解决方案，取50毫升HBSS 钙和镁，每10毫升组织糜，并添加500微升5毫克/毫升脱氧核糖核酸酶I（终浓度50微克/毫升），500微升2.5毫克/毫升胶原酶I / II和分散酶溶液（终浓度25微克/毫升），和500微升的1M HEPES缓冲液。在37℃水浴Prewarm消化解决方案。 为了制备肿瘤干介质（TSM）的基础上，混合250毫升的Neurobasal-A中，250毫升Dulbecco氏改良的Eagle培养基：营养混合物F12（DMEM / F12），5毫升100×抗生素 – 抗真菌剂，5毫升200mM的L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺二肽（GLUTAMAX-A），5毫升HEPES缓冲液，5毫升的100mM丙酮酸钠，和5mL 100×MEM非必需氨基酸。 与生长因子准备完整的TSM，添加以下补充TSM基地：50X B27负补充维生素A（1:50），人表皮生长因子（H-EGF，20毫微克/毫升），人成纤维细胞生长因子（H- FGF，20毫微克/毫升），人血小板衍生生长因子AA（H-PDGF-AA，10毫微克/毫升），人血小板衍生生长因子BB（H-PDGF-BB，10毫微克/毫升），和肝素溶液（2微克/毫升）。 预冷配备有吊桶式转子4℃的实验室离心机。 3.机械分离转移组织成高壁100毫米×20mm的细胞培养皿。航运取出介质下脚用10代替 – 15毫升冷培养基。 使用了弯曲止血把握刀片，细剁组织，同时消除明显的血管或脑膜。 注：最终组织片段应小于1mm（ 见图1B）。 转移组织到一个干净的50毫升锥形管中。用另外5毫升冷培养基洗涤细胞培养皿并转移到锥形管中。需要时，重复此清洗步骤转移剩余组织。 使用10毫升血清吸管，磨碎轻轻（4 – 5次）。允许更大的做卷烟UE片段沉降到管底部。如果需要的话，短暂离心样品1分钟（350 XG，4℃）。 收集机械分离的部分。 除去上清液，并通过100微米过滤器的过滤标成一个新的50 mL锥形管“机械分离”。颠倒了原锥形管过滤器和培养基洗恢复组织碎片。 离心“机械分离”分数为5分钟（350 XG，4℃）。 从沉淀的“机械分离”部分去除上清，重悬在寒冷的文化传媒组织。如果有超过5毫升的“机械解离”锥形管组织，分裂组织成其他50毫升锥形管中，使得没有管具有超过5毫升的组织。 储存在冰上机械离解分数直至蔗糖梯度离心步骤（步骤第5页）。可替代地，机械解离的部分可继续在酶解潜伏期（步骤4.4）步骤5。 4.酶解如果有超过5毫升的组织中含有剩余较大的组织碎片在管，分裂组织成其他新50mL的锥形管中，使得没有管具有超过5毫升的组织。 离心含有剩余组织碎片5分钟（350 XG，4℃）的锥形管（多个）。 除去上清液，并添加预热的酶消化溶液，使得存在5为每1毫升组织毫升消化溶液（ 例如，25 5毫升组织毫升消化溶液）。 密封该锥形管盖与实验室膜孵育旋转器上，反应在37℃下30分钟。 培养后，磨碎的样品轻轻地（参见图1C）。 用10毫升血清吸管，吸管样品上下6 – 8倍。避免产生过气泡。 一个1000微升吸管尖添加到吸管的端部和磨碎额外的6 – 8倍。 允许任何剩余块沉降到管底部。删除和过滤通过一个100微米的过滤器仍然悬浮在标有“酶解”一个新的50 mL锥形管的细胞上清并存储在冰上。 如果显著组织碎片依然存在，增加一个额外的10毫升HBSS钙和镁的碎片和重复步骤3.5.1和3.5.2。过滤通过100微米的过滤器进入“酶解”管这个最终的解决方案。 离心“酶解”管5分钟（350 XG，4℃）并继续蔗糖梯度离心。 5.蔗糖密度梯度离心如果样品仍然悬浮在溶液，centrifuGE 5分钟（350 XG，4℃）。 除去在20毫升冷HBSS的上清，重悬组织没有钙和镁。把音量高达25毫升总用冷HBSS。 慢慢加入25毫升1.8M的蔗糖溶液，并翻转试管混合。这导致了0.9M的蔗糖梯度。 没有制动器 10分钟（800 XG，4℃）离心。使用离心制动会扰乱梯度和降低产率（ 见图1D为一个样品的一例前和离心后）。 小心吸髓鞘碎片，并尽可能多的蔗糖溶液越好。通过加入30毫升冷HBSS无钙和镁，并轻轻混合洗样品。离心5分钟（350 XG，4℃）。 6. ACK红细胞溶解取出洗净上清。加入5毫升的ACK裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，漩管在室温1分钟。 淬火第l通过加入30毫升冷HBSS无钙和镁ysis。 离心5分钟（350 XG，4℃）。 7.首次保养文化重悬最终的细胞沉淀在10 – 15毫升温暖完整的TSM用生长因子和使用台盼蓝排除血球量化活细胞密度。 注：活细胞的变化范围很大，取决于组织捐赠的情况下，定量可能很难在早期阶段，由于剩余的细胞碎片。在理想的情况下，目标是具有每采样1万居住单元。当过多的碎片依然存在，在板材在T175烧瓶密度低的情况下。 转移的最终细胞悬浮液到一个新T75培养瓶。 Spike在另外的生长因子，隔日保持整体生长因子水平，并监测肿瘤细胞的神经球的发展（参见图1E和图2）。 可替代地，过程酶促解离的细胞用于进一步的分析，包括流式细胞仪和荧光激活细胞分选。 神经球的发展（其平均需要3 – 4周，但是从几天范围为只要2个月）后，使用100微米的尼龙网过滤器，以减少碎片的量反向滤波器的样本。 注意：滤液应在培养物中维持的情况下存活的单细胞或小球都存在。 通过进行DNA指纹而传代，在比较初始患者样品确保培养物的完整性和纯度。