Un protocollo per Rapid post-mortem delle cellule Cultura della diffusa intrinseca Pontine glioma (DIPG)

Questo protocollo è stato eseguito con l'approvazione dal nostro comitato istituzionale di revisione con adeguate de-identificazione di tutti i dati dei pazienti e in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Ottenere tutto appropriato istituzionale approvazione board review e il consenso informato da parte della famiglia del paziente prima di lavorare con questo protocollo. 1. Ottenere campioni di tessuto NOTA: Una componente fondamentale di questo protocollo richiede una corretta gestione della donazione di tessuti a partire immediatamente al momento della autopsia. La vitalità complessiva del campione dipende in modo significativo a ridurre al minimo l'intervallo post mortem (PMI), immediatamente trasferire il tessuto nel mezzo freddo appropriata integrata con antibiotici / antimicotici, mantenendo il campione in ghiaccio durante il trasporto, e il mantenimento di una tecnica sterile in tutto il protocollo. Dopo la notificadi una donazione imminente, preparare un kit per la raccolta del campione. Utilizzando una scatola di spedizione con un contenitore isolato che può essere utilizzato direttamente per il trasporto di ritorno del campione di tessuto, comprendere i materiali seguenti: Includere materiali per la preparazione sterili, compresi i guanti sterili, tende, e bisturi. Include 8 – 10 sterili 50 provette coniche ml contenente 30 mezzi di trasporto ml nel contenitore isolato con ghiaccio o impacchi freddi. NOTA: Durante qualsiasi supporto standard di coltura cellulare può funzionare, la migliore redditività del campione si ottiene con Hibernate-A integrato con antibiotico / antimicotico. Includere eventuali ulteriori tubi di esempio per altre analisi (ad esempio, fissativi). Se l'autopsia non sarà eseguita presso la sede del sperimentatore, includere un documento che indichi chiaramente come raccogliere il campione di tumore. Questo include dettagli come il mantenimento della sterilità, mantenendo le provette dei campioni in ghiaccio, e compresi i campioni dal mesencefalo e midollo come tumor cellule spesso invadono queste regioni. Mantenere la sterilità durante l'autopsia. Considerare il cervello sterile all'interno del cranio, in modo da osservare una tecnica sterile (compresi i guanti spogliatoi) una volta che il cranio è aperto. Evitare la contaminazione con la pelle e dei capelli è fondamentale. Sezionare il tumore dal lato ventrale (la "pancia" del ponte, vedi Supplemental Figura 1). Con un bisturi sterile, tagliare piccoli pezzi 1 cm dal tumore e trasferire immediatamente in mezzi di trasporto a freddo (vedi NOTA al punto 1.1.2) e mettere in ghiaccio bagnato. Mettere 10 mL di tessuto in ogni provetta, risultando in un volume finale di tessuto e media in ogni provetta di 40 mL. NOTA: Nel caso di DIPG, il tumore infiltra diffusamente il ponte e spesso il resto del tronco cerebrale. In quanto tale, raccogliere la maggior quantità di campione il più possibile, in genere di cui 3 – 4 tubi (30 – 40 ml di tessuto) dal ponte e 1 – 2 tubi (10 – 20 mL di tessuto) ciascuno da mesencefalo e midollo. raccogliere samples dal mesencefalo e midollo giustapposta alle Pons, che spesso contengono molte cellule tumorali. Dopo la raccolta del campione, spedire i campioni O / N sul ghiaccio bagnato nel contenitore isolato. Non spedire il campione in ghiaccio secco, come il congelamento uccidere le cellule. 2. Preparazione per l'elaborazione del campione Prima di iniziare la preparazione del campione, sterilizzare cappe di coltura tissutale con lame di rasoio, emostatiche curve, e tutti gli altri strumenti non sterili sotto la luce UV per 1 ora. Eseguite tutte le seguenti operazioni in condizioni sterili per evitare la contaminazione delle culture. Preparare e soluzioni di filtro sterili. Per preparare 1,8 M soluzione di saccarosio, sciogliere 308,07 g di saccarosio in 300 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 ml 10x Hank's-Buffered Saline Solution (HBSS) senza calcio o magnesio e portare il volume totale a 500 ml con acqua distillata. Conservare a 4 ° C. Per preparare la soluzione digestione enzimatica, prendere 50 mL HBSS con calcio e magnesio per ogni 10 ml di tessuto tritato e aggiungere 500 microlitri 5 mg / mL deossiribonucleasi I (concentrazione finale 50 mg / mL), 500 microlitri 2,5 mg / ml di collagenasi I / II e soluzione dispasi (concentrazione finale 25 ug / mL), e 500 microlitri di buffer 1 M HEPES. soluzione di digestione Preriscaldare a bagnomaria C 37 °. Per preparare stelo supporto (TSM) di base del tumore, mescolare 250 mL Neurobasal-A, di 250 mL Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 mL 100x antibiotico-antimicotico, 5 ml 200 mm L-alanil-L glutammina dipeptide (Glutamax-A), 5 mL tampone HEPES, 5 mL 100 mM sodio piruvato, e 5 mL 100x MEM aminoacidi non essenziali. Per preparare completa TSM con fattori di crescita, aggiungere i seguenti supplementi a base di TSM: 50x B27 Supplemento Minus vitamina A (1:50), fattore di crescita epidermico umano (H-EGF, 20 ng / mL), fattore di crescita fibroblasti umani (H- FGF, 20 ng / mL), fattore di crescita derivato dalle piastrine umane AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),umano piastrine-derivato fattore di crescita BB (H-PDGF-BB, 10 ng / mL), e la soluzione di eparina (2 mg / mL). Preraffreddamento una centrifuga da laboratorio dotato di un rotore oscillante benna a 4 ° C. 3. La dissociazione meccanica Trasferire il tessuto in un 100 millimetri piatto di coltura cellulare di alto pareti x 20 mm. Rimuovere avanzi di supporti da spedizione e sostituirli con 10 – 15 mL terreni di coltura freddo. Utilizzando i hemostats curve di cogliere una lama di rasoio, tritare finemente il tessuto durante la rimozione dei vasi sanguigni evidenti o meningi. NOTA: I frammenti di tessuto finale dovrebbe essere inferiore a 1 mm (vedere Figura 1B). Trasferire il tessuto in un tubo da 50 ml pulito. Lavare il piatto di coltura cellulare con l'aggiunta di 5 ml di terreni di coltura freddo e trasferire al tubo conico. Ripetere questa fase di lavaggio se necessario per trasferire il tessuto rimanente. Utilizzando una pipetta sierologica 10 mL, triturare delicatamente (4 – 5 volte). Consentire tiss più grandiframmenti ue di depositarsi sul fondo della provetta. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per 1 min (350 xg, 4 ° C). Raccogliere la frazione dissociato meccanicamente. Rimuovere il surnatante e filtrare attraverso un filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml etichettata "dissociazione meccanica." Invertire il filtro sul tubo conico originale e lavare con terreni di coltura per recuperare i frammenti di tessuto. Centrifugare la frazione "dissociazione meccanica" per 5 min (350 xg, 4 ° C). Rimuovere il surnatante dalla frazione pellet "dissociazione meccanica" e risospendere il tessuto in terreni di coltura freddo. Se vi è più di 5 mL di tessuto nel tubo conico "dissociazione meccanica", dividere il tessuto in altri tubi 50 mL coniche tale che nessun tubo ha più di 5 mL di tessuto. Conservare la frazione meccanicamente dissociato in ghiaccio fino alla fase di centrifugazione gradiente di saccarosio (Step 5). In alternativa, la frazione meccanicamente dissociato può passare al punto 5 durante il periodo di incubazione di dissociazione enzimatica (Passo 4.4). 4. enzimatica dissociazione Se vi è più di 5 mL di tessuto nel tubo contenente i frammenti di tessuto grandi rimanenti, dividere il tessuto in altre nuove provette coniche da 50 ml tale che nessun tubo ha più di 5 mL di tessuto. Centrifugare la provetta conica (s) contenente i frammenti di tessuto rimanenti per 5 min (350 xg, 4 ° C). Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione preriscaldata digestione enzimatica, tale che vi sia soluzione di digestione 5 mL per ogni 1 mL di tessuto (ad esempio, 25 mL soluzione di digestione per 5 mL di tessuto). Sigillare le palpebre tubo conico con parafilm e incubare la reazione su un rotatore a 37 ° C per 30 min. Dopo l'incubazione, triturare i campioni delicatamente (vedi Figura 1C). Utilizzando una pipetta sierologica 10 mL,pipetta il campione su e giù per 6 – 8 volte. Evitare la generazione di bolle d'aria eccessive. Aggiungere una punta di pipetta 1000 microlitri alla fine della pipetta e triturare altri 6 – 8 volte. Lasciare i restanti pezzi di depositarsi sul fondo della provetta. Rimuovere e filtrare il surnatante con le cellule ancora in sospensione attraverso un filtro 100 micron in un nuovo tubo da 50 ml con l'etichetta "enzimatica dissociazione" e memorizzare sul ghiaccio. Se significativi frammenti di tessuto rimangono, aggiungere un ulteriore 10 mL HBSS con calcio e magnesio ai frammenti e ripetere i punti 3.5.1 e 3.5.2. Filtrare la soluzione finale attraverso un filtro 100 micron nel tubo "enzimatica dissociazione". Centrifugare il tubo "enzimatica dissociazione" per 5 min (350 xg, 4 ° C) e proseguire al saccarosio centrifugazione in gradiente. 5. saccarosio centrifugazione in gradiente Se i campioni sono ancora sospese in soluzione, centrifuge per 5 min (350 xg, 4 ° C). Rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio. Portare il volume fino a 25 mL totale con HBSS freddo. Aggiungere lentamente 25 ml di 1,8 M soluzione di saccarosio e capovolgere il tubo per mescolare. Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio 0,9 M. Centrifugare senza freno per 10 min (800 xg, 4 ° C). Utilizzando un freno centrifugazione interromperà il gradiente e ridurre la resa (vedere Figura 1D per un esempio di un campione prima e dopo centrifugazione). attenzione aspirare detriti mielina e tanto soluzione di saccarosio possibile. Lavare il campione aggiungendo 30 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Centrifugare per 5 min (350 xg, 4 ° C). 6. ACK Globulo rosso Lysis Rimuovere il surnatante lavaggio. Aggiungere 5 ml di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, agitando la provetta per 1 minuto a temperatura ambiente. Placare la lYsis aggiungendo 30 mL HBSS freddo senza calcio e magnesio. Centrifugare per 5 min (350 xg, 4 ° C). 7. Manutenzione Cultura iniziale Risospendere il pellet cellulare finale in 10 – 15 mL caldo completo TSM con fattori di crescita e quantificare la densità di cellule vitali su un emocitometro utilizzando trypan esclusione blu. NOTA: La gamma di cellule vitali varia ampiamente a seconda delle circostanze della donazione di tessuti, e la quantificazione può essere difficile in questa fase iniziale a causa di detriti cellulari avanzi. In un caso ideale, puntare ad avere un milione di cellule vive per campione. Nei casi in cui rimane detriti eccessivo la piastra ad una densità più bassa in un pallone T175. Trasferire le sospensioni cellulari finali ad un nuovo pallone di coltura T75. Spike in fattori di crescita supplementari ogni altro giorno per mantenere i livelli complessivi di fattori di crescita, e monitorare lo sviluppo delle cellule tumorali neurosfere (vedi Figura 1E e Figura 2). In alternativa, le cellule di processo enzimaticamente dissociate per ulteriori analisi, tra cui citometria a flusso e fluorescenza-attivato l'ordinamento delle cellule. Dopo lo sviluppo di neurosfere (che in media prende 3 – 4 settimane, ma varia da pochi giorni a finchè 2 mesi), il filtro di invertire il campione utilizzando un filtro a rete di nylon 100 micron per ridurre la quantità di detriti. NOTA: Il filtrato deve essere mantenuta in coltura nel caso in cui singole cellule vitali o piccole sfere sono presenti. Garantire l'integrità e la purezza della cultura eseguendo DNA fingerprinting mentre passaging, confrontando il campione iniziale del paziente.