Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Dit protocol is uitgevoerd met de goedkeuring van onze institutionele review board met geschikte de-identificatie van alle patiëntgegevens en in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Het verkrijgen van de nodige institutionele review board goedkeuring en geïnformeerde toestemming van de familie van de patiënt voorafgaand aan het werken met dit protocol. 1. Het verkrijgen van weefselmonsters LET OP: Een cruciaal onderdeel van dit protocol vereist een goede afhandeling van de weefseldonatie met onmiddellijke ingang op het moment van de autopsie. De totale steekproef levensvatbaarheid is sterk afhankelijk van het minimaliseren van de Post-Mortem Interval (PMI), onmiddellijk overbrengen van het weefsel in de juiste koude medium aangevuld met antibiotica / antimycotica, het bijhouden van het monster op nat ijs gedurende het vervoer, en het handhaven van de steriele techniek in het hele protocol. na kennisgevingvan een op handen zijnde schenking, voor te bereiden een monster collectie kit. Met behulp van een scheepvaart doos met een geïsoleerde container die direct kunnen worden gebruikt voor de terugkeer transport van het weefselmonster, onder meer de volgende materialen: Omvatten materialen voor steriele bereiding, met inbegrip van steriele handschoenen, gordijnen, en scalpels. Omvatten 8-10 steriele 50 ml conische buizen met 30 ml scheepvaart media in de geïsoleerde container met ijs of koude packs. LET OP: Hoewel elke standaard celcultuur media kan werken, is de beste monster levensvatbaarheid verkregen met Hibernate-A, aangevuld met antibioticum / antimycoticum. Omvatten verdere monster buizen voor andere analyses (bijv fixatieven). Als de autopsie niet zal worden uitgevoerd op de site van de onderzoeker, zijn voorzien van een document waarin duidelijk staat hoe de tumor monster te verzamelen. Deze bevat details, zoals het handhaven van steriliteit, waardoor monsterbuizen op nat ijs, en met inbegrip van monsters van de middenhersenen en merg als tumor cellen binnenvallen vaak deze regio's. Handhaving van de steriliteit tijdens de autopsie. Denk aan de hersenen steriele binnen de schedel, zo observeren steriele techniek (met inbegrip van het veranderen van handschoenen) zodra de schedel is geopend. Zodat verontreiniging met huid en haar kritisch. Ontleden de tumor uit de ventrale zijde (de "buik" van de pons, zie Supplemental figuur 1). Met een steriele scalpel, snijd kleine 1 cm stukjes van de tumor en direct overdragen in koud verzending media (zie opmerking in stap 1.1.2) en op nat ijs. Breng 10 ml van weefsel in elke buis, wat resulteert in een uiteindelijk volume weefsel media in elke buis van 40 ml. OPMERKING: Bij DIPG, de tumor infiltreert diffuus pons en vaak de rest van de hersenstam. Als zodanig verzamel zoveel van het monster mogelijk, dat typisch 3-4 tubes (30 – 40 ml weefsel) van pons en 1-2 buizen (10-20 mL weefsel) van middenhersenen en medulla. Verzamel samselen van de middenhersenen en medulla geplaatst naast de pons, die vaak bevatten veel tumorcellen. Na de monstername, het schip de monsters O / N op nat ijs in de geïsoleerde container. Verschepen niet het monster op droog ijs, zoals het bevriezen van de cellen te doden. 2. Voorbereiding voor het monster verwerking Voorafgaand aan het begin monstervoorbereiding, steriliseren weefselkweek kap met scheermesjes, gebogen hemostats, en andere niet-steriele instrumenten onder UV licht gedurende 1 uur. Voer alle volgende stappen onder steriele omstandigheden om besmetting van de kweken te voorkomen. Bereid en steriele filter oplossingen. Tot 1,8 M sucrose oplossing te bereiden, te ontbinden 308,07 g sucrose in 300 ml gedestilleerd water. 50 mL voeg 10x Hank's-gebufferde zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium en brengt totale volume 500 ml met gedestilleerd water. Bewaren bij 4 ° C. Enzymatische vertering te bereiden, neem 50 ml HBSS met calcium en magnesium voor elke 10 ml gehakt weefsel en voeg 500 ul 5 mg / ml deoxyribonuclease I (eindconcentratie 50 gg / ml), 500 pl 2,5 mg / ml collagenase I / II en Dispase-oplossing (eindconcentratie 25 ug / ml) en 500 gl 1 M HEPES-buffer. Voorverwarmen spijsvertering oplossing in een 37 ° C waterbad. Om tumorstamcellen media (TSM) voor te bereiden die, meng 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM / F12), 5 ml 100x antibioticum-antimycoticum, 5 ml 200 mM L-alanyl-L- glutamine dipeptide (GlutaMAX-A), 5 ml HEPES-buffer, 5 ml 100 mM natriumpyruvaat en 5 ml 100x MEM niet-essentiële aminozuren. Om compleet TSM bereiden met groeifactoren, voeg de volgende aanvullingen op TSM basis: 50x B27 Supplement Minus Vitamine A (1:50), de menselijke epidermale groeifactor (H-EGF, 20 ng / ml), de menselijke fibroblast groeifactor (H- FGF, 20 ng / ml), humaan bloedplaatjes afgeleide groeifactor AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),menselijke bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml) en heparine-oplossing (2 ug / ml). Voorkoelen een laboratorium centrifuge uitgerust met een swinging-bucket rotor bij 4 ° C. 3. mechanische Dissociatie Breng het weefsel in een high-ommuurde 100 mm x 20 mm celkweek schotel. Verwijder media overblijfsel uit de scheepvaart en te vervangen door 10 – 15 ml koud kweekmedium. Met behulp van de gebogen hemostats te vatten een scheermesje, gehakt het weefsel fijn tijdens het verwijderen van de hand liggende bloedvaten of hersenvliezen. LET OP: De laatste weefsel fragmenten moet kleiner zijn dan 1 mm (zie figuur 1B). Breng het weefsel in een schone 50 ml conische buis. Was de celkweekschaal met 5 ml koud kweekmedium en plaats het conische buis. Herhaal deze wasstap als nodig is om de resterende weefsel te dragen. Met behulp van een 10 ml serologische pipet zachtjes vermaal (4-5 keer). Laat grotere tissue fragmenten naar de bodem van de buis. Eventueel kort centrifugeren van het monster gedurende 1 minuut (350 xg, 4 ° C). Verzamel de mechanisch gescheiden fractie. Verwijder de supernatant en filtreer het door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis met het label "mechanische dissociatie." Keer de filter over de oorspronkelijke conische buis en was met de cultuur media om weefsel fragmenten te herstellen. Centrifugeer de "mechanische dissociatie" fractie gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). Verwijder de bovenstaande vloeistof uit het ingehulde "Mechanische dissociatie" fractie en resuspendeer het weefsel in koud kweekmedium. Als er meer dan 5 ml van weefsel in de "mechanische dissociatie" conische buis, splitsen de andere weefsel in 50 ml conische buizen zodat geen buis meer dan 5 ml weefsel. Bewaar de mechanisch gedissocieerde fractie op ijs tot de sucrose gradiënt centrifugeren stap (Step 5). Als alternatief kan de mechanisch gedissocieerde fractie verder met stap 5 tijdens de enzymatische dissociatie incubatietijd (stap 4.4). 4. Enzymatische dissociatie Als er meer dan 5 ml van weefsel in de buis met de grotere resterende weefsel fragmenten gesplitst weefsel in de andere nieuwe 50 ml conische buizen zodat geen buis meer dan 5 ml weefsel. Centrifugeer de conische buis (buizen) die het resterende weefsel fragmenten gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). Verwijder de supernatant en voeg de voorverwarmde enzymatische digestie oplossing, zodat er 5 ml verteringsoplossing voor elke 1 ml weefsel (bijvoorbeeld 25 ml digestie oplossing voor 5 ml weefsel). Dicht de conische buis met deksels laboratorium film en incubeer de reactie op een rotator bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Na de incubatie vermaal de monsters voorzichtig (zie figuur 1C). Met behulp van een 10 ml serologische pipet,pipet het monster op en neer 6-8 keer. Vermijd het genereren van overmatige luchtbellen. Voeg 1000 ul pipet tip aan het eind van de pipet en vermaal nog eens 6-8 keer. Sta resterende brokken naar de bodem van de buis. Verwijder het supernatant filter met de cellen nog steeds onderbroken door een 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis met het label "Enzymatische dissociatie" en bewaar op ijs. Bij aanzienlijke weefselfragmenten blijven, voeg nog eens 10 ml HBSS met calcium en magnesium om de fragmenten en herhaal stappen 3.5.1 en 3.5.2. Filter deze laatste oplossing door een 100 pm filter in de "enzymatische dissociatie" tube. Centrifugeer de "enzymatische dissociatie" buis gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C) en blijft sucrosegradiënt centrifugatie. 5. sucrosegradiënt Centrifugeren Indien monsters nog steeds worden gesuspendeerd in oplossing, centrifugalege gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). Verwijder het supernatant en resuspendeer weefsel in 20 ml koude HBSS zonder calcium en magnesium. Breng het volume tot 25 ml totaal met koud HBSS. Voeg langzaam 25 ml 1,8 M sucrose-oplossing en keren de buis te mengen. Dit resulteert in een 0,9 M sucrose gradiënt. Centrifuge zonder rem voor 10 min (800 x g, 4 ° C). Middels een centrifugering rem verloop verstoren en de opbrengst verlagen (zie figuur 1D voor een voorbeeld van een monster voor en na centrifugeren). Zorgvuldig aspireren myeline puin en zoveel sucrose oplossing mogelijk. Was het monster door het toevoegen van 30 ml koud HBSS zonder calcium en magnesium en het mengen voorzichtig. Centrifugeer gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). 6. ACK Red Blood Cell Lysis Verwijder het wassen supernatant. Voeg 5 ml ACK-lysisbuffer en voorzichtig resuspendeer de celpellet, zwenken de buis gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Quench de llyse door toevoeging van 30 ml koude HBSS zonder calcium en magnesium. Centrifugeer gedurende 5 minuten (350 xg, 4 ° C). 7. Initial Cultuur Onderhoud Resuspendeer de uiteindelijke celpellet in 10-15 ml warm compleet TSM met groeifactoren en kwantificeren levensvatbare celdichtheid op een hemocytometer behulp van trypan blauw exclusie. LET OP: Het bereik van levensvatbare cellen varieert sterk afhankelijk van de omstandigheden van het weefsel donatie en kwantificatie kan moeilijk in dit vroege stadium te wijten zijn aan overgebleven cellulaire puin. In het ideale geval, gericht op een miljoen levende cellen per monster te hebben. In gevallen waarin buitensporige puin blijft plaat bij een lagere dichtheid in een T175 kolf. Breng de laatste celsuspensies om een ​​nieuwe T75 kolf. Aar extra groeifactoren om de dag algemeen groeifactor te handhaven, en toezien op de ontwikkeling van tumorcellen neurosferen (zie figuur 1E en figuur 2). Alternatief proces enzymatisch gedissocieerde cellen voor verdere analyse, waaronder flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. Na de ontwikkeling van neurosferen (die duurt gemiddeld 3-4 weken, maar varieert van een paar dagen zolang 2 maanden), omkeringsfilter het monster met een 100 um nylon zeef om de hoeveelheid afval te verminderen. NB: Het filtraat moet in de cultuur in het geval worden gehandhaafd levensvatbare enkele cellen of kleine bolletjes aanwezig zijn. De integriteit en zuiverheid van de cultuur door het uitvoeren van DNA-vingerafdrukken tijdens passage, in vergelijking met de oorspronkelijke patiëntmonster.