T淋巴细胞有丝分裂原诱导芽生的快速定量辨识免疫调节药物

所有实验均按照由莱特州立大学实验动物护理和使用委员会和机构审查委员会批准的协议进行的。 注意：人PBMC通过Ficoll密度梯度离心法5分离。 1.脾虚收获 房子成年雌性ICR小鼠与食品，水和被褥特定于物种要求标准实验室条件下。 注：动物有2.9个月，平均年龄和30.4 g的安乐死的时间平均重量。 在隔离（DOI）之日起，安乐死的动物没有单独存在的其他同种动物。尽一切努力，以确保最小的压力鼠标。用安乐死的 CO 2继发颈椎错位，以确保死刑。 将动物，还是转移笼子里，入二氧化碳室和STA室温以5升/分钟的气流。该流速在每分钟推荐10-30％置换氧气。 动物是无意识后，增加的 CO 2流速15升/分。检查动物呼吸停止，并在该腔室离开另外2分钟。 适用于颈椎脱位伴扩张力，以确保死刑。 收获使用死亡10分钟内无菌技术动物脾脏。 消毒两套剪刀和镊子的用于在高压釜使用烘箱之前的取出脾脏。通过应用70％乙醇消毒的剥离面。 应用70％的乙醇对小鼠腹部。使用一组剪刀和镊子的，使得在从腹部的左侧的毛皮和皮肤的切口，然后拉开和剥离背部皮肤以显示腹膜。一旦接触，打开腹膜前应用4％洗必泰溶液。 使用第二组脊髓损伤ssors和钳子，使沿中央腹部2至3厘米切口。打开腹膜并切除内脏附件和多余的脂肪取出脾脏。放置在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）脾脏。 2.生脾细胞的制备注意：使用执行无菌技术层流生物安全柜下的所有步骤。 浸泡收获脾脏在10ml去离子灭菌的 H 2的O 5分钟在10cm的培养皿以溶解表面红细胞。 注意：如果脾脏隔离过程中损坏该步骤可以省略。 要释放脾，美眉2无菌载玻片之间的脾脏（磨砂面朝脾）在一个新的10厘米培养皿。用10毫升的RPMI-1640的补充有10％胎牛血清，2mM的L-谷氨酰胺，50IU / ml青霉素和50微克/ ml链霉素（下面称为一个混合氏完全RPMI）。 过滤通过无菌40微米尼龙细胞过滤器的细胞进入一个新10厘米培养皿以除去结缔组织和碎片。 裂解通过加入20ml的RBC裂解缓冲液，在pH 7.4的155毫氯化铵 ，10毫碳酸氢钠 ，和0.1mM EDTA组成和〜300毫渗透摩尔浓度/升的其余红细胞。 注：渗透压由冰点或蒸汽压渗透压力计测定。 转移细胞从10厘米的板到50ml锥形管中并离心，在250×g离心10分钟（4℃）。 除去上清液，添加20毫升RBC裂解缓冲液中，并通过移液重悬浮沉淀的细胞。 在室温下孵育的裂解缓冲液10分钟，并轻轻摇动。 离心机在250 xg离心（4℃）10分钟以沉淀细胞。倒出裂解缓冲液。 重悬的细胞在10ml完全RPMI和离心机的试（250 XG，10分钟，4℃）。圆盘ARD上清液。 重新悬浮的脾细胞在2ml完全RPMI中温热至37℃，然后转移到尼龙羊毛纤维列。 3. T细胞的分离纯化 用5毫升完全RPMI洗两次尼龙棉柱。在1小时，5％CO 2的细胞培养箱中在37℃。 注意：这是必须保持尼龙羊毛湿为实验的持续时间和使用的完全RPMI温热至37℃，所有的尼龙羊毛分离步骤。 孤立的脾细胞添加到列和孵育1小时，以使B细胞，成纤维细胞，和辅助细胞粘附到尼龙羊毛。 加2ml的RPMI含有脾细胞到柱并穿过直到达到尼龙羊毛的顶部。 2毫升完全RPMI中添加加热到37℃，在尼龙毛的顶部，并通过毛传递介质直到液面到达顶部表面。 加入3毫升温完全RPMI中到塔以完全覆盖尼龙羊毛。 孵育在37℃，5％CO 2的细胞培养箱中不受干扰1小时的装载柱。 通过用5ml完全RPMI中洗涤柱两次洗脱的细胞。通过离心执行洗脱细胞的额外洗涤。 柱填充顶端2次完全RPMI，并允许在列中的溶液流过到50毫升的无菌锥形管中。 注：避免敲击或撞击之列，这可以撞出B细胞，辅助细胞和成纤维细胞附着在尼龙毛。 收集在250 xg离心流过级分和自旋10分钟（4℃）使细胞沉淀。用10毫升完全RPMI洗一次。再次沉淀细胞（250 xg离心，10分钟，4℃）并在2毫升完全RPMI中重新悬浮。 测量的C使用ELL密度血球和在完全RPMI稀释到0.5×10 6个细胞/ ml。 种子1或2萃取池的等分试样到24或6孔细胞培养板，分别的各孔中，并培养所述细胞在37℃，5％的CO 2。 注：1毫1,4-二硫苏糖醇（DTT）可添加到每个孔中在此阶段，提高T细胞的存活。 可选：确认隔离协议通过流式细胞仪的效率。该协议通常产生〜80％T淋巴细胞23。 注：尼龙羊毛纯化细胞含有约50％ 的 CD4 +和23％的CD8 +细胞。以进一步纯化的CD4 +和CD8 +亚群，单免疫耗竭步骤可以使用八个抗体和磁珠24来执行。可替代地，更纯的CD4 +和CD8 + T细胞群可通过用特异性抗体阳性或阴性选择分离。 _title“> 4。T细胞的激活和实验药物暴露通过增加的PMA和离子霉素的钙盐或涂覆有抗CD3和抗CD28抗体23,25,26磁珠激活隔离的24小时之内的T淋巴细胞。在激活时添加试验药物（ 如，环孢素，FK506，雷帕霉素，TRAM-34，和FTY720）。 注意：在此，PMA浓度的2至250毫微克/毫升变化，并且离子霉素浓度保持在250纳米。如果可能的话，稀释应当从库存等分试样的每种药物，以使添加到细胞中的每个孔的体积为≥1微升，以确保可重复性制备。 1珠 – 细胞比：抗CD3 /抗CD28包被的磁珠在1中添加。增加每个细胞（ 即，胎圈至细胞比）小珠的数量将增加刺激25,26的强度。珠洗涤并再悬浮于完全RPMI它们的加入到细胞中之前。需要注意的是台盼蓝色污渍珠。 培养在37℃，5％的CO 2与自动细胞计数器分析前将细胞12-72小时。 5.自动细胞计数仪数据采集 运行示例之前，请确保细胞轻轻地用血清吸管，避免团块混合。这是因为它们的增加的密合性的活化的淋巴细胞特别重要。 对于与抗CD3 / CD28珠粒激活，吸液后培养，将样品转移到1.5ml或2毫升离心管中。通过保持管上的磁体1-2分钟分离珠。使用包含用于分析的细胞上清液。 注：分析1小时内两个静息和活化的细胞以考虑通过血清中存在的培养基中的静止细胞的任何预先活化。 PMA的12小时后/离子霉素刺激，细胞大小略有增加被检出（ 图2 </STRONG>）。在72小时，比较无显著细胞大小增加，观察48小时（数据未显示）。 传输1毫升细胞悬浮液到一个样品杯，并通过自动细胞计数器根据手册中的说明运行它。 注：对于每一个试验中，应该使用的最小的细胞培养物1毫升（最多2毫升）中。的自动细胞计数器使用的注射器与细胞悬浮液混合锥虫蓝和过该被成像和由软件进行分析的场传递细胞 – 台盼蓝混合物。软件检测台盼蓝染色的细胞，得出每个小区绕了一圈，并确定直径。 100图像从每个样品收集，以及细胞存活率和确定尺寸。这里使用的细胞计数器的检测阈值具有5微米的下限。 从各传输数据运行，以供进一步分析的电子表格。 校准设备上使用1定期为6μm和8μm的直径的聚苯乙烯珠毫升样品。 注意：由生产每批测定的实际珠尺寸应该使用，而不是标称尺寸。图6和8微米的珠是方便的，因为这些直径是接近静止的预期直径和活化的T细胞（参见图1）。 6.数据和统计分析 使用合适的统计和图形软件分析数据。 注意：每次运行的电子表格中包含的细胞，每个直径数（范围：5微米到70微米）。一个17微米的直径以上的细胞从分析中删除排除粉尘颗粒和小气泡，这可通过在仪器被解读为活细胞。 执行假设用韦尔奇的t检验数据集的方差不等测试;结果被认为如果p <0.001统计学显著。使用的公式是， <im克ALT =“公式1”SRC =“/文件/ ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg”/> 哪里和是样本均值， 和是样本方差，以及和是样本大小为每个数据集。的自由度的数目，使用两个样本大小为每个比较的小保守估计。条形图表示为平均值±SEM表示。 7.脾T淋巴细胞增殖试验 使用MTS-或基于MTT比色读板器增殖测定测量T细胞增殖。 注：该法为基础在MTS四唑化合物（欧文的试剂）还原成可溶性甲产物，可能是由NADPH或NADH d在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的。 计数纯化的T细胞与血球和在完全RPMI-1640以1×10 6个细胞/ ml的终密度重悬它们。 注：1毫摩尔DTT可在此阶段被加入到细胞中。 激活用PMA的细胞并用试验药物离子霉素一起，如果需要的话，和轻轻混匀（类似于步骤4）。 板100微升在96孔细胞培养物处理板的每孔的细胞，并在37℃下孵育，用5％CO 2的48小时。加入100微升的RPMI-1640培养基的无细胞进入一个孔，以获得背景吸光度的读数。 加入20μl基于MTS的试剂至各孔，并在37℃，5％的CO 2孵育4小时。 用酶标仪采取在490nm吸光度测量。在一个bsorbance测量对应于每个代谢活性细胞的数量很好。 注：如有需要减去背景水平。背景吸光度值取决于培养基，血清，外部pH值，和MTS试剂暴露时间的光的类型。基于MTS-试剂对光敏感，并曝光了几个小时，可能会导致更高的背景吸光值。