면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

모든 실험은 라이트 주립 대학 실험 동물 관리 및 사용위원회와 임상 시험 심사위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행된다. 주 : 인간 PBMC를 피콜는 밀도 구배 원심 분리 방법 (5)에 의해 분리된다. 1. 비장 수확 주택의 성인 종에 고유 한 음식, 물, 침구 요구 사항 표준 실험실 조건에서 여성 ICR 마우스. 주 : 동물은 2.9 개월, 평균 연령 안락사시에 30.4 g의 평균 중량을 가졌다. 분리 (DOI)의 날짜에 개별적으로 존재하는 다른 conspecific 동물없이 동물을 안락사. 마우스에 최소한의 스트레스를 보장하기 위해 모든 노력을합니다. 사망을 위해 보조 경추 탈구 CO 2를 이용하여 안락사. 이산화탄소 챔버 역으로, 전송 케이지 안에 여전히 동물을 배치5L / 분의 가스 흐름을 실온. 이 유량은 분당 권장 10~30%에서 산소를 변위시킨다. 동물 의식 후 / 분으로 15 L에 CO 2 유량을 증가시킨다. 호흡의 중단을 위해 동물을 확인하고 추가로 2 분 동안 챔버에 둡니다. 죽음을 보장하기 위해주의 산만의 힘으로 자궁 경부 전위를 적용합니다. 죽음의 10 분 내에 무균 기술을 사용하여 동물에서 비장을 수확. 사용하기 전에 오븐을 오토 클레이브에서 비장을 제거하고 가위 집게 두 세트 소독. 70 % 에탄올을 적용하여 절개면을 소독. 마우스 복부에 70 % 에탄올을 적용합니다. 가위와 집게의 한 세트를 사용하여 한 떨어져 당겨 복막을 공개하는 피부를 다시 껍질, 복부의 왼쪽에서 털과 피부에 상처를합니다. 노출되면, 복막를 열기 전에 4 % 클로르헥시딘 솔루션을 적용 할 수 있습니다. SCI의 제 2 세트를 사용하여ssors와 집게는 중앙 복부를 따라 2 ~ 3 cm 컷을합니다. 복막을 열고 내장 첨부 파일과 여분의 지방을 멀리 절단하여 비장을 제거합니다. 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 비장를 놓습니다. 원시 비장 2. 준비 참고 : 무균 기술을 사용하여 층류 바이오 안전성 캐비닛 아래의 모든 단계를 수행합니다. 표면 적혈구를 용해시키기 위해 10cm 배양 접시에 5 분 동안 탈 멸균 H 2 O 10 ml의 수확 된 비장을 담근다. 참고 : 비장을 분리하는 동안 손상된 경우이 단계는 생략 할 수 있습니다. , 비장 세포를 분리 신선한 10cm 배양 접시 위에 (비장에 직면 프로스트 측)이 멸균 유리 슬라이드 사이의 비장을 분쇄합니다. 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 50 IU / ㎖의 페니실린으로 보충 된 RPMI-1640 10 ㎖, 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (a 지칭 이하 섞어들) RPMI를 완료합니다. 결합 조직 및 파편을 제거하기 위해 새로운 10cm 배양 접시에 멸균 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 를 Lyse 20 pH 7.4의 155 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 NaHCO3을 0.1 mM의 EDTA로 이루어진 RBC 용해 완충액 ml의 ~ 300 mOsm / L을 첨가함으로써 잔류 적혈구. 참고 삼투압은 빙점 또는 증기압 삼투압에 의해 측정된다. 10 분 (4 °에 C) 250 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 10 cm 판에서 세포를 전송합니다. 상기 상등액을 제거 적혈구 용해 완충 용액 20 mL를 넣고 피펫 팅하여 세포 펠렛을 다시 일시. 부드럽게 흔들 10 분 동안 용해 완충액에서 실온에서 인큐베이션. 250 XG (4 °에 C)에서 10 분 동안 원심 분리기 세포 펠렛합니다. 용해 완충액을 붓는다. 다시 완전한 RPMI 원심 분리기의 10 ㎖ (250 XG, 10 분, 4 ° C)에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 디스크뜨는 ARD. 완전한 RPMI 2 ㎖에 비장 세포를 다시 일시는 나일론 울 섬유 칼럼으로 이송하여 37 ° C로 가온. T 림프구 3. 정제 전체 RPMI 5 ㎖로 두 번 나일론 울 열을 씻으십시오. 1 시간 동안 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션. 주 : 실험 기간 동안 습식 나일론 울을 유지하고 완전 RPMI 모두 나일론 울 분리 단계는 37 ° C로 가온 사용하는 것이 필수적이다. 열 절연에 비장 세포를 추가하여 B 세포, 섬유 아세포, 및 액세서리 세포 나일론 울에 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 배양한다. 컬럼에 비장 세포를 포함하는 RPMI 2 ㎖를 추가하고 나일론 울의 상단에 도달 할 때까지 통과. 나일론 울의 상단에 예열 37 ° C에 전체 RPMI 2 ㎖를 추가하고 양모를 통해 매체를 통과액면 상부면에 도달 할 때까지. 완전히 나일론 울 다루 컬럼에 따뜻한 완료 RPMI 3 ㎖를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 방해받지로드 열을 품어. 완전한 RPMI 5 ㎖로 두 번 칼럼을 세척하여 세포를 용출. 원심 분리하여 용출 된 세포의 추가 세척을 수행합니다. 전체 RPMI와 상위 2 배에 열을 채우고 열의 용액을 50 ml의 멸균 원뿔 튜브를 통해 흐르게 할 수 있습니다. 참고 : 탭 또는 나일론 울에 부착 된 B 세포, 액세서리 세포 및 섬유 아세포을 제거 할 수있는 열을 가하지 마십시오. 세포 펠렛 10 분 (4 °에 C) 250 XG에 플로우를 통해 부분과 스핀를 수집합니다. 전체 RPMI 10 ㎖로 한 번 씻으십시오. (250 × g으로 10 분, 39 ° C)를 다시 세포 펠렛을 완전 RPMI 2 ㎖에 재현 탁. 는 C를 측정 엘 밀도 혈구를 사용하여 0.5 × 106 세포 / ml로 완전 RPMI에 희석. 시드 1을 각각 24 개, 6 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 2 ㎖ 씩, 문화, 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포. 주 : 1 mM의 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 T 세포의 생존을 향상시키기 위해이 단계에서 각 웰에 첨가 할 수있다. 선택적 : 유동 세포 계측법에 의해 분리 프로토콜의 효율을 확인한다. 이 프로토콜은 일반적으로 23 ~ T 림프구는 80 %를 산출한다. 참고 : 나일론 울 정제 된 세포는 약 50 % CD4 + 23 %는 CD8 + 세포가 포함되어 있습니다. 상기 CD4 +와 CD8 + 개체군 정화 단일 면역 자기 붕괴 단계 8 개의 항체 및 자성 비드 (24)를 사용하여 수행 될 수있다. 이와 달리, 순수 CD4 + 및 CD8 + T 세포 집단이 특이 적 항체와 양성 또는 음성 선별에 의해 단리 될 수있다. _title "> 4. T 림프구의 활성화 및 실험 약물 노출 PMA의 추가를 통해 칼슘 염 또는 항 CD3 및 항 CD28 항체 23,25,26로 코팅 자석 구슬 이오 노마 이신 격리의 24 시간 내 T 림프구를 활성화합니다. 활성화시 실험 약물 (예를 들어 사이클로스포린, FK506, 라파 마이신, TRAM-34 및 FTY720) 추가한다. 참고 : 여기에, PMA 농도는 2 ~ 250 ng를 / ㎖에서 변화하고, 이오 노마 이신 농도는 250 nm에서 유지 하였다. 가능하면 세포의 각 웰에 첨가 볼륨 재현성을 보장 ≥1 μL가되도록, 희석 각 약물의 분취 스톡으로부터 제조한다. 1 비드에 세포 비율 : 항 CD3 / 안티 CD28 코팅 자석 구슬은 1에서 추가됩니다. (즉, 비드에 세포 비) 셀당 비드의 수를 늘리면 자극 (25, 26)의 강도를 증가시킬 것이다. 비드를 세척하고 세포에 첨가 전에 그들의 완전 RPMI에 재현 탁된다. 그 트리 판을 참고파란색 구슬을 얼룩. 문화 자동 세포 계수기로 분석하기 전에 5 % CO 2와 37 ° C에서 12-72 시간 동안 세포. 5. 자동 셀 카운터 데이터 수집 샘플을 실행하기 전에 세포를 부드럽게 덩어리를 피하기 위해 혈청 학적 피펫과 혼합되어 있는지 확인합니다. 이 때문에 증가 된 접착 성 림프구 활성화에 특히 중요하다. 피펫 팅 한 후, 항 CD3 / CD28 비드 활성화 문화를 들면, 1.5 ㎖의 2 mL의 원심 분리 튜브에 시료를 옮긴다. 1 ~ 2 분 동안 자석에 튜브를 유지하여 구슬을 분리합니다. 분석을위한 세포를 포함하는 상층 액을 사용합니다. 참고 : 배양액에 존재하는 혈청에 의한 휴식 세포의 사전 정품 인증을 고려하여 1 시간 이내에 모두 휴식과 활성화 된 세포를 분석 할 수 있습니다. PMA 12 시간 후 / 이오 노마 이신 자극, 셀 크기의 작은 증가가 검출되었다 (도 2 </강한>). 48 시간을 관찰 한 72 시간에서 유의 한 세포의 크기가 증가했다 (데이터는 제시하지 않음)에 비해 없다. 샘플 컵에 전송 세포 현탁액 1 ㎖를하고 설명서의 지침에 따라 자동 세포 계수기를 통해 실행합니다. 참고 : 시험의 각각에 대해, 세포 배양 1 ㎖ (2 ㎖의 최대)의 최소 사용되어야한다. 자동 세포 계수기는 세포 현탁액과 트리 판 블루를 혼합하는 주사기를 사용하여 묘화와 소프트웨어에 의해 분석하는 분야에 걸쳐 트리 판 블루 세포 혼합물을 전달한다. 이 소프트웨어는 트리 판 블루 염색 된 세포를 감지 각 셀 주위에 원을 그립니다, 그리고 직경을 결정한다. 이미지 (100)는 각 샘플로부터 수집하고, 세포 생존 및 크기가 결정된다. 여기에 사용 된 세포 계수기의 검출 임계치는 5 ㎛의 하한을 갖는다. 각각의 전송 데이터가 추가 분석을 위해 스프레드 시트로 실행합니다. 1을 이용하여 정기적으로 보정 장치6 μm의 8 μm의 직경 폴리스티렌 비즈 ml의 샘플. 주 : 각 배치 제조업체에 의해 측정 된 실제 비드 크기를 표기하지 공칭 크기. 이러한 직경 휴지 예상 직경 활성화 T 세포에 근접하기 때문에도 6 및 8 ㎛의 비드 (도 1 참조)를 편리하다. 6. 데이터 및 통계 분석 적절한 통계적 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다. 참고 : (: 5 μm의 70 μm의 범위) 각 실행에 대한 스프레드 시트는 각각 직경 세포의 수를 포함합니다. 17 μm의 직경을 상기 세포는 먼지와 같은기구에 의해 생존 세포를 읽을 수있는 작은 기포를 배제하는 분석에서 제거된다. 동일하지 않은 분산과 데이터 세트에 대한 웰치의 t-test를 이용하여 테스트 가설을 수행; 결과는 P <0.001 경우 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다. 사용되는 식이었다, <img의 고도 = "식 1"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg"/> 어디에 과 샘플 수단이, 과 샘플 차이가 있으며, 과 각 데이터 세트에 대한 샘플 크기입니다. 자유도의 수는 보수적 각각 비교를 위해 두 개의 샘플 크기가 작은을 이용하여 추정된다. 막대 그래프는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. 7. 비장 T 림프구 증식 분석 MTS- 또는 MTT 기반 비색 플레이트 리더 증식 분석을 사용하여 T 세포 증식을 측정한다. 주 : 분석은 기본이다NADPH 또는 NADH에 의한 가능성이 MTS의 테트라 졸륨 화합물 (오웬의 시약) 가용성 포르 마잔 제품 감소에 d를 탈수소 효소에 의해 대사 활성 세포에서 생성. 혈구 정제 T 세포 카운트를 1 × 106 세포 / ㎖의 최종 농도로 완전 RPMI-1640을 다시 일시. 주 : 1 mM의 DTT이 단계에서 세포에 첨가 할 수있다. PMA와 함께 세포를 활성화하여 필요한 경우, 시험 약물 이오 노마 이신과 함께, (4 단계와 유사 함)을 부드럽게 혼합한다. 플레이트 (100)를 96- 웰 세포 배양 처리 된 플레이트의 각 웰에있는 세포의 μL 및 48 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 배경 흡광도의 독서를 얻기 위해 한 우물에 세포없이 RPMI-1640 미디어 100 μl를 추가합니다. 각 웰에 MTS 기반 시약의 20 μl를 추가하고 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서 흡광도 측정을 수행. 다음은bsorbance 측정 각 웰에서 대사 적 활성 세포의 수에 대응한다. 참고 : 필요한 경우 배경의 수준을 뺍니다. 백그라운드 흡광도 값은 광 배양 배지, 혈청, 외부의 pH 및 MTS 시약 노광 기간의 타입에 의존한다. MTS 계 시약은 광 민감하고, 수 시간 동안 노광 높은 배경 흡광도 값을 초래할 수있다.