免疫調節薬を同定するためのTリンパ球におけるマイトジェン誘導性の幼若の迅速定量

すべての実験はライト州立大学研究室動物実験委員会及び治験審査委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されています。 注：ヒトPBMCを、Ficoll密度勾配遠心分離法5によって分離されています。 1.脾臓収穫 ハウス大人の種に固有の食料、水、および寝具の要件に標準的な実験室条件の女性ICRマウス。 注：動物は安楽死の時点で2.9ヶ月の平均年齢および30.4グラムの平均重量を有していました。 アイソレーション（DOI）の日に、個別に存在する他の同種の動物せずに動物を安楽死させます。マウスに最小限のストレスを確保するためにあらゆる努力を行います。死を確実にするために、二頸椎脱臼でCO 2を使用して安楽死させます。 CO 2室と駅に、まだ転送ケージの内側に、動物を置きます5L /分のガス流量を室温。この流量は、毎分推奨10~30％の酸素を置換します。 動物が意識不明になった後、15L /分にCO 2流量を増加させます。呼吸停止のために動物を確認し、さらに2分間チャンバー内に残します。 死を確実にするために伸延力で頸椎脱臼を適用します。 死の10分以内に、無菌技術を用いて動物から脾臓を収穫。 使用するオーブン前にオートクレーブ中で脾臓の除去のためにハサミやピンセットの2セットを滅菌します。 70％エタノールを適用することによって、切開面を滅菌します。 マウスの腹部に70％エタノールを適用します。はさみや鉗子の1セットを使用して、腹部の左側から毛や皮膚にカットを行い、その後引き離すと腹膜を明らかにするために皮膚をバック剥離。暴露されると、腹膜を開く前に、4％クロルヘキシジン溶液を適用します。 SCIの第2のセットを使用してssorsと鉗子、中央の腹部に沿って2〜3 cmのカットを行います。腹膜を開き、内臓添付ファイルや余分な脂肪を切り欠いて脾臓を除去します。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で脾臓を置きます。 生脾細胞の調製注：無菌技術を用いて、層流生物学的安全キャビネットの下にあるすべての手順を実行します。 表面の赤血球を溶解するために10cmの培養皿に5分間、脱イオン滅菌H 2 O 10ml中に回収した脾臓を浸します。 注：脾臓が単離中に破損した場合は、この工程を省略することができます。 脾細胞を解放するには、新鮮な10cmの培養皿上で2滅菌ガラススライド（脾臓に面したつや消し側）との間に脾臓をつぶします。呼ば下に（10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640 10mlを、2mMのL-グルタミン、50 IU / mlのペニシリン、及び50μg/ mlのストレプトマイシンを混ぜます）RPMI完全秒。 結合組織および破片を除去するために、新しい10cmの培養皿に滅菌40μmのナイロン細胞ストレーナーを通して細胞をフィルタリングします。 溶解pHが7.4〜300ミリオスモル/ Lで155 mMのNH 4 Cl を 、10mMの炭酸水素ナトリウム、および0.1mM EDTAからなるRBC溶解緩衝液を20mlを加えることにより、残りの赤血球。 注：浸透圧は、凝固点または蒸気圧浸透圧計によって測定されます。 10分間（4℃）250×gで50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に10 cmのプレートから細胞を転送します。 上清を除去し、RBC溶解緩衝液の20ミリリットルを追加し、ピペッティングによりペレット化した細胞を再懸濁します。 穏やかに揺り動かしながら10分間、溶解緩衝液中で、室温でインキュベートします。 細胞をペレット化するために250×gで（4℃）で10分間遠心分離します。溶解バッファーを捨てます。 再び完全RPMIと遠心分離機の10ミリリットル（250×gで、10分間、4℃）中で細胞を再懸濁します。ディスク上清をARD。 完全RPMIを2mlに再懸濁脾細胞をナイロンウール繊維カラムへの転送のために37℃に温めました。 Tリンパ球の3精製 完全RPMI 5mlで二回ナイロンウールカラムを洗浄します。 1時間、5％CO 2細胞培養インキュベーター中で37℃でインキュベートします。 注：これは、実験期間中湿潤ナイロンウールを維持するために、完全RPMIすべてナイロンウール分離工程のために37℃に温め使用することが必須です。 カラムに単離された脾細胞を追加し、B細胞、線維芽細胞、およびアクセサリー細胞は、ナイロンウールに付着できるようにするために、1時間インキュベートします。 カラムに脾細胞を含むRPMIの2ミリリットルを追加し、ナイロンウールの最上部に到達するまでに通過。 完全RPMIの2mlをナイロンウールの上に37℃に温め、追加ウールを通して媒体を通過液面が上面に達するまで。 完全にナイロンウールをカバーするために列に暖かい完全RPMIの3ミリリットルを追加します。 1時間、37℃、5％CO 2細胞培養インキュベーター中で平静充填したカラムをインキュベートします。 完全RPMI 5mlで二回カラムを洗浄することにより細胞を溶出させます。遠心分離により溶出した細胞の追加の洗浄を行います。 完全RPMIでトップ2倍に列を記入し、カラム内の溶液を50mlの滅菌コニカルチューブに流れることを可能にします。 注：ナイロンウールに付着したB細胞、補助細胞、および線維芽細胞を取り除くことができ、列をタップするかぶつけないでください。 細胞をペレットに10分間（4℃）を250×gでのフロースルー画分とスピンを収集します。完全RPMI 10mlで1回洗浄。 （250×gで、10分間、4℃）、再び細胞をペレット化し、完全RPMI 2mlに再懸濁します。 Cを測定しますエル密度血球計数器を用いて0.5×10 6細胞/ mlに完全RPMIに希釈します。 種子1またはそれぞれ24-または6-ウェル細胞培養プレートの各ウェルに細胞を2mlのアリコートを、培養5％CO 2で37℃で細胞。 注：1mMの1,4-ジチオスレイトール（DTT）は、T細胞の生存率を向上させるために、この段階で各ウェルに添加することができます。 オプション：フローサイトメトリーにより単離プロトコールの効率を確認してください。このプロトコルは、通常、Tは23リンパ球〜80％が得られます。 注：ナイロンウール精製された細胞は、約50％のCD4 +および23％のCD8 +細胞を含みます。さらに、CD4 +及びCD8 +亜集団を精製するために、単一の免疫枯渇段階は、8つの抗体および磁気ビーズ24を用いて行うことができます。代替的に、より純粋なCD4 +およびCD8 + T細胞集団は、特異的抗体を用いて陽性または陰性選択によって単離することができます。 _title "> 4。Tリンパ球の活性化と実験的薬物暴露 PMAの添加によりカルシウム塩または抗CD3および抗CD28抗体23,25,26で被覆した磁気ビーズイオノマイシン分離の24時間内のTリンパ球を活性化します。起動時に実験的な薬物（ 例えば、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、TRAM-34、及びFTY720）を追加します。 注記：ここでは、PMAの濃度は、2〜250 ng / mlでの変化、及びイオノマイシン濃度を250 nmで維持しました。可能な場合、細胞の各ウェルに添加量が再現性を確保するために≥1μLになるように、希釈液を各薬物のストックのアリコートから調製されるべきです。 1のビーズ対細胞比の抗CD3 /抗CD28でコーティングした磁気ビーズは1で添加します。細胞あたりのビーズの数（ すなわち、ビーズ対細胞の比）を大きくすると、刺激25,26の強度を増加させます。ビーズを洗浄し、細胞へのそれらの添加前に、完全RPMI中に再懸濁させます。なお、トリパン青いビーズを染色します。 文化自動細胞カウンターを用いて分析する前に、5％CO 2で37℃で12-72時間のための細胞。 5.自動セルカウンターデータの収集 サンプルを実行する前に、細胞を穏やか塊を回避するために、血清学的ピペットで混合されていることを確認してください。これは、その増加した接着性の活性化リンパ球のために特に重要です。 ピペッティングした後、抗CD3 / CD28ビーズで活性化された培養物については1.5 mlまたは2mLの遠心管に試料を移します。 1-2分間磁石上にチューブを保持することによりビーズを分離します。分析のための細胞を含む上清を使用してください。 注：培養培地中に存在血清により休止細胞のいずれかのプレ活性化を考慮して1時間以内に休止および活性化細胞の両方を分析します。 PMA /イオノマイシン刺激の12時間後、細胞サイズの小さな増加（ 図2検出可能でした</強いです>）。 72時間目、48時間と比較して有意なセルサイズの増加は、（データは示さない）が観察されませんでした。 サンプルカップへの転送細胞懸濁液の1ミリリットルを、マニュアルの指示に従って自動セルカウンターを介して実行。 注：試験のそれぞれについて、細胞培養物1ml（2 mlで最大値）の最小値を使用すべきです。自動細胞計数は、細胞懸濁液を、トリパンブルーを混合するために注射器を使用して画像化し、ソフトウエアにより解析されたフィールド上に細胞をトリパンブルー混合物を通過させます。ソフトウェアは、トリパンブルー染色細胞を検出し、各セルの周りに円を描画し、直径を決定します。 100画像は、各サンプルから回収され、そして細胞の生存率およびサイズが決定されます。ここで使用されるセルカウンタの検出閾値は、5ミクロンの下限を有します。 各のデータを転送して、さらなる分析のためにスプレッドシートに実行します。 1を使用して、定期的に装置のキャリブレーション6ミクロンと8ミクロンの直径のポリスチレンビーズmlのサンプル。 注：各バッチの製造業者によって測定された実際のビーズサイズが使用されるべきではなく、公称サイズ。これらの直径は、安静時の予想直径および活性化T細胞に近いので、6と8μmのビーズは、（ 図1を参照）便利です。 6.データと統計解析 適切な統計やグラフソフトウェアを使用してデータを分析します。 注：（：5ミクロン〜70ミクロンの範囲）それぞれの実行のためのスプレッドシートは、各直径の細胞の数が含まれています。 17μmの直径、上記細胞は、塵埃粒子及び器具などによって生細胞を読み出すことができる小さな気泡を排除するために分析から除外されています。 仮説は不等分散を持つデータ・セットのウェルチのt検定を使用してテストを実行します。 P <0.001場合の結果は統計的に有意であると考えています。使用される式があって、 <imグラムのALT = "式1" SRC = "/ファイル/ ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg" /> どこそしてサンプル手段であり、 そしてサンプルの分散であり、 そして各データ・セットのサンプルサイズです。自由度の数は、保存的にそれぞれの比較のために2つのサンプルサイズの小さい方を使用して推定されます。棒グラフは平均±SEMとして提示されています。 7.脾臓Tリンパ球増殖アッセイ MTS-またはMTTに基づく比色プレートリーダー増殖アッセイを使用して、T細胞増殖を測定します。 注：このアッセイは、ベースでありますNADPHまたはNADHによって可能性がMTSテトラゾリウム化合物（オーエン試薬）可溶性ホルマザン産物への還元、上のdは脱水素酵素により代謝的に活性な細胞で産生さ。 血球計数器を用いて精製したT細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度で完全RPMI-1640で再懸濁します。 注：1 mMのDTT、この段階で細胞に添加することができます。 （工程4と同様に）必要であれば、試験薬と一緒にPMAおよびイオノマイシンで細胞を活性化し、穏やかに混合します。 プレート96ウェル細胞培養プレートを処理し、48時間、5％CO 2で37℃でインキュベートの各ウェル中の細胞100μl。バックグラウンド吸光度の読み取りを得るために、1つのウェルに細胞を含まないRPMI-1640培地100μlのを追加します。 各ウェルにMTSベースの試薬を20μlを添加して、4時間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。 プレートリーダーを用いて490nmでの吸光度測定を行います。 Absorbance測定は、各ウェル中の代謝活性細胞の数に相当します。 注：必要に応じて、バックグラウンドレベルを減算します。バックグラウンド吸光度の値は、光に、培養培地、血清、外部pH、およびMTS試薬の曝露期間の種類に依存します。 MTSベースの試薬は光に敏感であり、数時間のための光への暴露は、より高いバックグラウンド吸光度の値になることがあります。