Исследования, направленные на развитие нейротоксичности (AIDN), вызванные анестезией, были сосредоточены на грызунах, которые в широком смысле не применимы к людям. Модели приматов, не связанные с человеком, более актуальны, но являются дорогостоящими и сложными в использовании для экспериментов. Порошок, напротив, представляет собой клинически значимую, практичную модель для животных, идеальную для изучения анестезирующей нейротоксичности.
Анестезию нельзя избежать во многих случаях, когда требуется хирургическая операция, особенно у детей. Недавние исследования на животных вызвали опасения, что воздействие анестезии может привести к апоптозу нейронов, известному как нейротоксичность развития, вызванная анестезией (AIDN). Кроме того, некоторые клинические исследования у детей предположили, что воздействие анестезии может привести к дефициту нейродеструкции позже в жизни. Тем не менее, идеальная модель животных для доклинического исследования еще не разработана. Неонатальный поросенок представляет собой ценную модель для доклинического исследования, поскольку они имеют поразительное количество сходств развития с людьми.
Анатомия и физиология поросят позволяют осуществлять строгие человеческие периоперационные состояния как в процедурах выживания, так и при отсутствии выживания. Катетеризация половых артерий позволяет проводить тщательный мониторинг, что позволяет оперативно корректировать любые отклонения жизненных признаков и химиотерапии поросят. яКроме того, между поросятами и новорожденными человека существует множественное сходство в развитии. Методы, необходимые для использования поросят для экспериментов, потребуют опыта для освоения. Педиатрический анестезиолог является критическим членом следственной группы. В общем случае мы описываем подходящее использование модели поросенка для исследования нейроразвития.
Каждый год миллионы детей в США получают общую анестезию, многие из которых моложе 4 лет. Анестезирующая нейротоксичность развития (AIDN) стала предметом исследования детской анестезии, поскольку стало необходимо понять влияние анестезии на незрелые мозги. Предыдущие исследования показали, что обычно используемые анестетики, такие как изофлуран, могут приводить к увеличению апоптоза нейронов в мозге молодых животных. Исследования у детей дали двусмысленные результаты 2 . Понимание патогенеза AIDN, определение потенциальных терапевтических целей для его профилактики или улучшения, а также описание наиболее безопасных режимов анестезии стали неотложными задачами сообщества педиатрической анестезии. Основная цель этого исследования заключалась в разработке оптимальной модели и метода животных для количественной оценки эффектов анестетиков на развивающийся мозг и тщательного стимулированияРазработал исследование безопасности широко используемых анестетиков.
В недавнем систематическом обзоре существующей структуры доклинической литературы по AIDN авторы отметили значительную методологическую гетерогенность в более чем 900 исследованиях 3 . Многие считают, что это призыв к клинически актуальной, хорошо продуманной доклинической модели, которая еще не существует, несмотря на несколько лет исследований по этому вопросу. Большинство моделей грызунов, по необходимости, используют подход, который не допускает тщательного физиологического мониторинга, отбора проб крови или механической вентиляции. Поскольку мозг изящно чувствителен к физиологическим расстройствам, трудно полагаться на результаты таких моделей. Первичной целью разработки этой модели было ее проектирование таким образом, чтобы все физические параметры, такие как параметры газового газа, температура тела, параметры дыхания и т . Д., Контролировались и корректировались, когда это необходимо.
<p class = "jove_content"> Кроме того, поскольку нейротоксичность анестезии, вероятно, зависит от прогресса развития мозга во время воздействия, следует выбрать модель для животных, которая лучше всего имитирует развитие и структуру новорожденного человеческого мозга, чтобы максимизировать Трансляционная значимость результатов 4 . Модель трансляционного поросенка обеспечивает уровень клинической значимости, который требуется в этих обзорах и редакционных статьях, поскольку он предназначен для решения этой проблемы для соответствующих доклинических данных, которые могут информировать о будущих клинических исследованиях.Изофлуран, агонист рецептора GABA типа A (GABA A ) и слабый антагонист NMDA-рецептора, является широко используемым ингаляционным анестетиком в клинической практике во всем мире. Анестетики, такие как изофлуран, считаются безопасными до тех пор, пока они не вызывают гипотонии или гипоксии; Тем не менее, возможны более тонкие эффекты. Когда мозг подвергается общей анестезии, баланс ГАМК aГонизм и антагонизм NMDA, что приводит к изменениям в клеточной архитектуре, связности и функции. Кроме того, хотя ГАМК обычно является ингибирующим нейромедиатором, он, как известно, является возбуждающим в незрелых мозгах 5 . Именно, когда переход ГАМК от возбуждающего к ингибирующему действию не совсем понятен и, вероятно, зависит от вида.
Когда дисбаланс между возбуждающим и тормозящим введением в мозг происходит во время так называемого «роста роста мозга», возникающая в результате экситотоксическая дисрегуляция критических молекулярных путей может привести к аномальной нейродеструкции, такой как апопетическая нейродегенерация. В дополнение к увеличению апоптоза могут также индуцироваться окислительный стресс и воспаление, тогда как пролиферация нейронных клеток, миграция нейронов и аксональная арбонизация становятся подавленными или дисрегуляционными 6 . Конечным результатом являются нейрокогнитивные нарушения, которые могут сохраняться в adulМолот 2 .
Для непосредственного измерения нейротоксических эффектов изофлурана у молодых млекопитающих используются неонатальные поросята. Поросенки больше похожи на CNS с людьми, чем с любым другим млекопитающим, и поэтому их нейроразвитие и нейроанатомическое сходство делают их идеальным животным для клинически значимой модели млекопитающих AIDN. Как у людей, так и у поросят есть гиренцефалические мозги, которые имеют сходство в характере и распределении мозговых гири, серого вещества и белого вещества. Поросенок-гиппокамп, базальные ганглии и стволы головного мозга также топографически подобны таковым у людей 7 . С точки зрения развития поросят являются одним из немногих нечеловеческих млекопитающих, которые подвергаются перинатальному росту мозга и миелинизации 8 . В утробе мозг человека и поросят испытывает значительный рост во время беременности в конце триместра. В корреляции, при рождении, мозг человека и поросят составляет 27% и 25% взрослого мозга соответственно, Магнитно-резонансная томография показала, что один недельный мозг поросенка примерно эквивалентен месячному мозгу человека с точки зрения созревания нейронов и дендритной арборизации 9 . Кроме того, поросенок и человеческий мозг имеют большое сходство в отношении моделей нейроразвития. Например, экспрессия и последовательность мРНК reelin 10 , топографическое распределение нейронов 5-HT 11 и закрытие 12 нервной трубки все параллельны тому, что наблюдается у людей. Кроме того, существует обширная гомология между геномами поросят и людей 13 .
Уместность модели животного следует понимать в контексте патологии человека, особенно в отношении зрелости мозга и патобиологии человеческого младенца. Большинство существующих исследований токсичности анестезии используют модель грызунов, а некоторые используют нечеловеческиеМодели приматов. Однако грызуны и приматы не могут быть идеальными животными для исследования AIDN.
Хотя они широко используются, мозг грызунов сильно отличается от мозга людей на протяжении всего развития. Наиболее заметно, что грызуны обладают лиссенцефальными (или гладкими) мозгами. В мозге грызунов отсутствуют гири и сульчи, характерные для более неврологически сложных организмов. Мозг грызунов также подвергается постнатальному отростку 14 роста мозга, отличающемуся от людей и поросят. Было отмечено, что существуют различия в уязвимости различных областей мозга к ингаляционной анестезии 15 . Поэтому важно, чтобы модель животных для изучения AIDN обладала мозгом, который является неврологически и нейроанатомически подобным мозгу, с тем чтобы лучше всего моделировать изменения, вызванные анестезией, которые могут быть замечены у педиатрических пациентов. Как описано выше, поросята обладают мозгом, что iГораздо лучше подходит для этой роли. Кроме того, общие формы нейрокогнитивного тестирования грызунов, такие как пространственное обучение и память, оцененные в водном лабиринте Морриса, не имеют прямого отношения к нейрокогнитивным оценкам у маленьких детей 16 . Одним из преимуществ использования поросят для развития нейронауки является то, что они чрезвычайно чувствительны к нейрокогнитивному тестированию даже в раннем возрасте. Многочисленные нейрокогнитивные тесты, которые считаются полезными для других видов млекопитающих, успешно используются и подтверждены у свиней. Хотя все еще развивающаяся область, нейрокогнитивная оценка у поросят включает более сложные тесты, которые лучше имитируют человеческий дефицит, такой как тест 17 , 18 наклонного луча , а также тест на пространственную информированность 19 . Испытания двигателя с наклонным лучом в рамках травматического исследования повреждений головного мозга у поросят показывают высокую надежность оценкиФункции двигателя. Зеркальный тест демонстрирует память об окружающей среде, а также признание и использование отраженного изображения для поиска награды за питание.
С другой стороны, не-человеческие приматы могут быть более подходящей моделью для исследований детской анестезии, но существует ряд непомерно высоких факторов, включая стоимость и трудность использования. Кроме того, они чрезвычайно чувствительны к условиям раннего выздоровления, особенно к разделению стресса и материнства. Факторы, важные для изучения AIDN, такие как аллостерические модуляторы, аффинности рецептор-лиганд, посттрансляционные модификации, рецепторные субъединичные композиции и альтернативные варианты сплайсинга, неизвестны в случае приматов. Это связано с тем, что гены, имеющие отношение к таким понятиям, не были клонированы. Напротив, они были клонированы у свиней. Таким образом, для приматов нечеловека были выполнены лишь ограниченная работа 21 , 22 </suр>.
Модель поросенца использует преимущества моделей приматов грызунов и нечеловеков: она экономична, проста в использовании по сравнению с исследованиями приматов, отличных от человека, и нейроанатомически и нейрофизиологически похожа на педиатрический мозг человека. В последние годы использование поросят в исследованиях нейронауки выросло, в том числе ряд исследований, в которых изучались педиатрические нейровоспалительные состояния. Воздействие респираторной вирусной инфекции на гиппокамп и пространственное обучение 23 , уменьшение смерти клеток головного мозга после инсульта 24 , нейрогенез после травматического повреждения мозга 25 и активность ферментов во время судорог 26 являются некоторыми исследованиями, которые использовали неонатальных поросят. Этот значительный и растущий объем литературы придает силу пригодности и устойчивости клинически значимой и сильно воспроизводимой модели поросят для изучения анестезииSia-индуцированная нейротоксичность.
Критические шаги протокола / устранение неполадок
По мере начала эксперимента мониторинг неинвазивных жизненно важных признаков должен начинаться с индукции. Кровяное давление, сердечный ритм, насыщение кислородом и ректальная температура могут быть легко получены и контролироваться. Поросенок должен находиться под устройством для подогрева воздуха для поддержания адекватной температуры тела, так как эти животные могут быстро стать гипотермически под общей анестезией. Быстрое размещение периферического внутривенного катетера позволяет лечить чрезвычайные ситуации, если они возникают во время индукции. Важно постоянно следить за поросенком, неинвазивно или инвазивно, как по изофлурановой процедуре, так и по процедуре жертвоприношения. Порошок может испытывать десатурацию артериального кислорода очень быстро в течение нескольких этапов в течение всего протокола, особенно во время управления дыханием и интубации. Мы используем 8% -ный севофлуран для индукции анестезии, чтобы воспроизвести педиатрическую практику человека и описатьD индукция. Однако 5% изофлуран был успешно использован и подходит. Учитывая различия в анатомии и предрасположенность к ларингоспазму, поросенок может быть трудно интубировать. Если порошок начинает десазорить во время индукции и / или управления дыхательными путями, 100% кислорода и севофлурана следует немедленно вводить через конус лица, чтобы восстановить безопасный уровень насыщения кислородом и адекватную глубину анестезии. Имейте в виду, что, хотя плоскость анестезии должна быть достаточно глубокой, чтобы позволить интубацию, чрезмерная анестезия может привести к апноэ. Требуется непрерывная бдительность в отношении вентиляции и оксигенации животного, соответственно, титрование ингаляционной анестезии. Затем интубацию можно повторно активировать после восстановления оксигенации и достижения адекватной анестезии. Можно попытаться обеспечить вентиляцию положительного давления через конус лица, но, как правило, не удается. Если возникает ларингоспазм, применение раствора лидокаина непосредственно в голосДля подтверждения трахеальной интубации.
Экстренные лекарства всегда должны быть доступны и должны применяться по мере необходимости во время критических частей протокола для исправления физиологических нарушений. В то время как тщательное обсуждение наркотического и экстренного употребления наркотиков у поросят выходит за рамки этой рукописи, «Swine in the Laboratory: Хирургия, анестезия, визуализация и экспериментальные методы» Swindle – отличный ресурс. 27
Аналогично, поросенок может начать быстро обессохляться во время жертвоприношения, после открытия грудной полости во время средней линии стернотомии. Оператор должен работать быстро, но безопасно, чтобы открыть сердце и вставить ангиокатетер, чтобы запустить холодный PBS. Для предотвращения ишемического повреждения головного мозга необходима тщательная холодная перфузия PBS (и быстрая фиксация с помощью PFA, если указано).
После того, как поросенок был интубирован, респиратор( Табл. 1 ). Стабилизируйте приливную оксигенацию и вентиляцию поросенка путем титрования поддержки вентилятора при сохранении адекватной анестезии. Мы используем механическую вентиляцию, чтобы имитировать то, что используется у людей как можно ближе. Следует избегать гиперэксии, чтобы минимизировать вероятность окислительного стресса.
Порошки изофлурана подвергаются канюлю бедренной артерии по двум причинам: постоянно контролировать артериальное давление; И образец артериальной крови для оценки состояния кислотной основы, газов крови и электролитов на протяжении всей процедуры. Канюляция бедренной артерии может быть сложной задачей. Подробнее см. Видео. Для экспериментов по выживанию эта процедура должна проводиться в стерильной операционной среде в стерильных условиях. После канюлирования бедренной артерии начните ежечасный мониторинг артериального кровяного газа и сывороточных электролитов, исправив при необходимостиПоддерживать гомеостаз ( табл. 1 ). Порошок должен получать непрерывную содержащую декстрозу изотоническую жидкость для поддержания адекватного уровня глюкозы в крови. На протяжении всего эксперимента животное должно постоянно контролироваться для нормотермии, и при необходимости необходимо обеспечить принудительное воздушное потепление. Не менее важно избегать гипотермии и гипертермии.
Хотя этот протокол обеспечивает одно полушарие «свежего» мозга и одного полушария фиксированной нервной ткани, это можно легко адаптировать для альтернативных схем исследования. Дополнительные образцы также могут быть собраны у поросенка. CSF можно получить после обезболивания поросенка с помощью или без проведения рентгеноскопии. Кровь может также собираться у поросенка на разных стадиях протокола, включая катетер бедренной артерии, а также непосредственно из левого желудочка через ангиокатетер непосредственно перед перфузией. Период выздоровления также может быть увеличен или sh Ortened, для изучения хронического или острого ответа, соответственно.
Ограничения техники
Этот протокол и модель технически сложны. Требуется квалифицированный исследователь и полностью поставляемый операционный набор, особенно для экспериментов по выживанию. Исследователь (и помощник, для определенных частей протокола) должен быть удобным как с хирургическим, так и с анестетическим компонентом этого протокола, что может потребовать обучения и опыта для овладения. Другие ограничения включают в себя расходы на поросят по сравнению с моделями грызунов, хотя модель поросенков намного дешевле, чем приматов, не относящихся к человеку. В то время как стоимость поросят будет варьироваться в зависимости от региона и фермы, из которых получены животные, можно ожидать, что стоимость на животное будет меньше 500 долларов США, тогда как приматы нечеловека могут составлять тысячи долларов на животное. По нашему опыту, средняя стоимость животного обычно составляет около 200 долларов.
Jove_content "> Наконец, поскольку цель модели поросенок имитировать развивающийся человеческий мозг, следует использовать только неонатальных поросят. Центральная нервная система наиболее уязвима в период быстрого роста, а у поросят этот период простирается от За шесть недель до рождения до пяти недель после рождения 8. Использование старших поросят, более отдаленных от даты их опороса, несут риск ослабления клинической значимости модели поросенка. Несмотря на наличие значительных противоречий в отношении «эквивалентности» развития мозга поросят до Что у новорожденного человека наблюдаются поразительные сходства, когда сравнивается раннее развитие постнатального мозга между людьми и свиньями. По рождению мозг человека и свиней составляет соответственно 27% и 25% взрослого веса. 14 Основываясь на работе Джонсона И коллег, мы можем заключить, что одна неделя поросенка примерно эквивалентна одному человеческому месяцу. 9 Эти результаты, основанные на wh Оле-мозгового объема, были подтверждены работой Работника и его коллег. 28 Мы выбрали поросят 7-14 дней, чтобы приблизиться к человеку в возрасте 1-2 месяцев. Тем не менее, может быть разумным использовать более молодых животных (1-5 дней), если экспериментальная цель состоит в том, чтобы имитировать зенит пороха развития роста поросят. Это возможно, поскольку поросят можно отнимать от груди при рождении. Наше использование модели поросенок будет адаптировано по мере поступления новых данных в отношении параллелей между развитием постнатального мозга человека и свиньи.Значение техники в отношении альтернативных / существующих методов
Поросенок обладает поразительным сходством с новорожденными человека, включая критические параллели в развитии мозга и патофизиологических реакциях. Таким образом, клинически значимая модель млекопитающих и исследование доказательной концепции показывают, что поросенок является подходящей моделью для исследования анестезирующей нейротоксичностиRef "> 29 , 30. Он также может быть легко адаптирован к другим типам исследований нейронауки развития. Модель предназначена для исследования с научной точки зрения степени и механизма AIDN, сводящих к минимуму опасения, что смутные факторы, такие как гипоксия или гиперкарбия, являются Вызывая неврологический ущерб, который может быть неверно истолкован как вызванный анестезией. Для этого поросят обрабатывают те же периоперационные хирургические и анестезирующие условия и мониторинг, которым подвергаются педиатрические пациенты.
Будущие направления и приложения после освоения техники
Двигаясь вперед, поросят также очень чувствительны к нейрокогнитивным испытаниям 17 . Этот атрибут позволит провести комплексную, всестороннюю оценку нейрокогнитивного результата после анестезирующего воздействия в будущих экспериментах. Следует также подчеркнуть, что в клинических условиях дети чаще всего подвергаются анестезииФизиологически стрессовая процедура (операция). Взаимодействие между анестезией и постхирургическим воспалением, а также результирующее повреждение нейронов и / или токсичность (как видно у грызунов и приматов) заслуживают дальнейшего изучения и значительного рассмотрения. Порошок новорожденного представляет собой уникальную, клинически значимую базовую модель для воздействия анестетиков на развивающийся мозг без смешения влияния операции (имитация общих клинических сценариев у детей). Воздействие различных видов хирургии или других факторов (ишемия, черепно-мозговая травма, генетическая предрасположенность и т. Д.) Теперь может быть надежно проверено с использованием этой модели.
В лаборатории мы планируем использовать несколько электрофизиологических и электрохимических методов для дальнейшего изучения механизмов анестезии и AIDN в интактных нейронных цепях. Эти методы включают in vivo измерение активности нейротрансмиттера, записи цельноклеточных патч-зажима, нейровизуализации иНейрофизиологические исследования в срезах мозга. Что касается нейронауки в незрелом мозге, поросята более важны для человека, чем мышиные модели с очень немногими недостатками, присутствующими у нечеловеческих приматов. С дальнейшим развитием поросят могут быть идеальной моделью для исследований нейронауки человека.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы отметить вклад Университета штата Огайо, центр лабораторных ресурсов животных (ULAR).
Liqui-Wean | Milk Specialities | 454836 | |
Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
Masterflex L/S Peristaltic Pump | Cole-Parmer | EW-77916-20 | Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved |
Masterflex L/S Pump Tubing, 25ft | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
14-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381164 | |
10X PBS | Thermo-Fisher Scientific | ||
Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148-5KG | Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased. |
2-methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Needle holder | Teleflex | 152720 | |
Right angle clamp | Teleflex | 496217 | |
Rongeurs | Teleflex | 028120 | |
Tenotomy scissors | Teleflex | 423480 | |
Stitch scissors | Teleflex | 423440 | |
McPherson Tying Forceps | Teleflex | 425200 | |
Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
3-0 nylon suture | Medline | ETH627H | |
Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
Laryngoscope handle | Teleflex | 8710000 | |
Miller 1 Laryngoscope blade | Teleflex | 2216100 | |
Bair Hugger | 3M | 750 | |
Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
iStat Handheld | Abbott Point of Care | 300 | Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used |
iStat Cartridges | Abbott Point of Care | CG8+ | |
Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive | Ethicon | DNX6 | |
LMA Laryngotracheal Atomization Device | Teleflex | MAD720 | A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used |
Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube | Teleflex | 5-10106 | This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment |
Pediatric Intubation Stylet | Smiths Medical | 100/120/100 | |
24-gauge angiocatheter | Becton-Dickson | 381112 | |
#10 Disposable Scalpel | Ted Pella, Inc | 549-9-10 | |
Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter) |
Cook Medical | C-PMSY-300-FA | Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used |
Intramedic PE90 Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-12D | |
Monoject Blunt Cannula | VWR International | 15141-144 |