Preparación de cortes horizontales de ratón adulto Retina de Estudios electrofisiológicos
概要
Hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal de la retina de mamíferos adultos con el plano de seccionamiento en paralelo a la superficie de la retina. campos dendríticas de las neuronas de la retina orientadas nonradially no fueron truncados, lo que permite el estudio de las técnicas de procesamiento de señales con patch-clamp y de imagen.
Abstract
el tramo preparativos verticales están bien establecidos para estudiar los circuitos y la transmisión de la señal en la retina de mamíferos adultos. El plano de seccionamiento en estas preparaciones es perpendicular a la superficie de la retina, lo que es ideal para el estudio de las neuronas orientados radialmente como fotorreceptores y células bipolares. Sin embargo, las grandes cenadores dendríticas de las células horizontales, células amacrinas de campo amplio, y las células ganglionares son en su mayoría truncado, dejando marcadamente reducida la actividad sináptica en estas células. Mientras que las células ganglionares y células amacrinas desplazadas se pueden estudiar en una preparación de todo ello montado de la retina, células horizontales y células amacrinas ubicadas en la capa nuclear interna sólo son de difícil acceso para los electrodos en el tejido retina conjunto.
Para lograr la máxima accesibilidad y la integridad sináptica, hemos desarrollado una rodaja de preparación horizontal de la retina del ratón, y estudiamos la transmisión de señales en la sinapsis entre los fotorreceptores y horizontalCélulas. seccionamiento horizontal permite (1) la identificación visual fácil e inequívoca de los cuerpos celulares horizontales para la orientación del electrodo, y (2) la preservación de los campos dendríticas de células horizontales extendidos, como requisito previo para el cono de entrada sináptica intacta y funcional a las dendritas de células horizontales.
Las células horizontales de los cortes horizontales exhibieron actividad sináptica tónica en la oscuridad, y ellos respondieron a breves destellos de luz con una reducción de la actividad sináptica actual y la disminución hacia el interior. pruebas de inmuno indica que casi todos los conos dentro del campo de una célula dendrítica horizontal establecen sinapsis con las dendritas sus periféricos. La preparación rebanada horizontal es por lo tanto muy adecuado para estudiar las propiedades fisiológicas de las neuronas de la retina horizontalmente extendidos, así como la transmisión de la señal sensorial y la integración a través de las sinapsis seleccionados.
Introduction
La información visual se codifica como un patrón espacio-temporal dinámica de la activación de los fotorreceptores, y la sinapsis cinta entre los fotorreceptores y neuronas de segundo orden determina la transferencia de aguas abajo de la información visual. La preparación rebanada vertical de la retina de mamífero es una herramienta muy valiosa para estudiar el procesamiento de señales en las vías verticales, es decir, entre los fotorreceptores y células bipolares, y entre las células bipolares y algunos tipos de células amacrinas 1, 2, 3, 4.
Sin embargo, seccionamiento verticales siempre provoca el truncamiento grave de los campos dendríticas de muchas neuronas de la retina, lo que lleva a una pérdida considerable de los contactos sinápticos. Especialmente en la retina externa, las células horizontales se ven afectados debido a sus campos dendríticas extendidos lateralmente extendidas y sus sistemas de terminales del axón 5. En una línea verticalrodaja de preparación, la entrada sináptica de cientos de terminales de cono fotorreceptores a las dendritas de una célula horizontal se reduce a unos pocos contactos dispersos. Esto podría ser suficiente para estudiar las propiedades de las sinapsis individuales, pero lo hace de ninguna manera representan las capacidades de procesamiento de señal que subyacen a la activación sincronizada de las sinapsis cinta fotorreceptor.
Por lo tanto, hemos desarrollado una preparación rebanada horizontal, lo que deja casi todo el fotorreceptor cono de entrada sináptica a las dendritas de células horizontales intacto y funcional. El plano de carreras de seccionado paralelo a la superficie de la retina, idealmente corte a través de la capa nuclear interna entre las células horizontales y células amacrinas. Por lo tanto, las rebanadas horizontales de la retina externa son creados que contienen, en el sitio presináptico, fotorreceptores con segmentos interior y exterior, así como terminales sinápticas, y células horizontales y células bipolares en el sitio postsináptica. Esta preparación es muy adecuado to investigar las entradas sinápticas coordinadas en las dendritas de células horizontales por todos los conos dentro de su campo dendríticas. Por lo tanto, podría resultar útil para comprender mejor el funcionamiento de la sinapsis cinta fotorreceptor, que es crucial para la transferencia de la información visual de la matriz de la activación de los fotorreceptores en una respuesta postsináptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
En contraste con las rebanadas verticales, la morfología dendrítica de las neuronas orientados radialmente, como las células horizontales y amacrinas está bien conservado. En comparación con las preparaciones de retina enteros, estos tipos de células son fácilmente accesibles para los microelectrodos y pueden ser estudiados por ambas técnicas electrofisiológicas y de imagen. Aquí, nos centramos en la retina externa; Sin embargo, un enfoque similar se ha informado sobre todo para las células amacrinas de la re…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 and FE464/11-1 to A.F. The authors want to acknowledge the excellent technical assistance of Andrea Nerz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma | A1420 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Carbogen | Air Liquide | ||
| Agarose | Sigma | A9045 | |
| 35-mm petri dish (plastic) | Nunc Thermofisher | 150318 | |
| Glass petri dish | Chemoline | 50-1470-40 | |
| Isoflurane | Dispensary university hospital | ||
| Vibratome injector blade | Biosystems | 39053250 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200 | |
| Vibrocheck | Leica Microsystems | ||
| Microwave | |||
| Water bath | |||
| Forceps | |||
| 20-gauge needles | |||
| Spring scissors | |||
| Curved scalpel blades | |||
| Stereo microscope | |||
| Plastic Pasteur pipette | |||
| Glass Pasteur pipette |
参考文献
- DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse. Neuron. 50, 735-748 (2006).
- Jackman, S. L., et al. Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response. Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).
- Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods. J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).
- Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse. Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).
- Peichl, L., González-Soriano, J. Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig. Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).
- Ames, A., Nesbett, F. B. In vitro retina as an experimental model of the central nervous system. J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).
- Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J. Vis. Exp. (49), (2011).
- Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. Development of the Retina. , (1998).
- Feigenspan, A., Babai, N. Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).
- Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. Horizontal slice preparation of the retina. J. Vis. Exp. (1), e108 (2006).
- Babai, N., et al. Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses. J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).
- Thoreson, W. B. Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai). Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).
