imagen confocal en vivo ofrece biólogos con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la imagen confocal en vivo de flores en desarrollo de Arabidopsis.
El estudio del crecimiento y desarrollo de la planta ha dependido durante mucho tiempo en las técnicas experimentales utilizando tejidos muertos, fijos y que carecen de celulares de resolución adecuada. Los recientes avances en microscopía confocal, junto con el desarrollo de numerosos fluoróforos, han superado estos problemas y ha abierto la posibilidad de estudiar la expresión de varios genes simultáneamente, con una buena resolución celular, en muestras vivas. imagen confocal en vivo proporciona los biólogos de plantas con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo, y se ha utilizado ampliamente para estudiar el crecimiento radicular y la formación de órganos laterales sobre los flancos del meristemo apical. Sin embargo, no ha sido ampliamente aplicado al estudio del desarrollo de la flor, en parte debido a los problemas que son específicos para la formación de imágenes de flores, tales como los sépalos que crecen sobre el meristemo flor, y filtrar la fluorescencia de los tejidos subyacentes. A continuación, presentamos un protocolo detallado para llevar a cabo la imagen confocal en vivo en vivo, desarrollando Árabeidopsis capullos, ya sea utilizando un montante o un microscopio invertido.
La mayor parte del cuerpo de la planta forma post-embrionaria de grupos de células madre situadas en o cerca de la punta – o meristemos apicales – de los brotes y raíces. Todas las estructuras por encima del suelo de la planta adulta derivan del meristemo apical del brote (SAM), que produce continuamente órganos laterales en sus flancos: Hojas durante la fase vegetativa, y meristemos florales (FM) después de que éste pase a la fase reproductiva. FM a su vez se convierten en flores. Mientras que la Arabidopsis SAM produce órganos laterales de una en una, en un patrón repetitivo, espiral, fms producir cuatro tipos de órganos florales dentro de cuatro verticilos, de una manera parcialmente síncrono, con múltiples programas de desarrollo desentrañar simultáneamente. Las redes genéticas que subyacen a la especificación de la identidad de los diferentes órganos florales se han descifrado parcialmente (para revisiones, véanse las referencias 1, 2), pero muchos aspectos de la flor development, tales como floral de posicionamiento de órganos y la definición de los límites entre verticilos, siguen siendo poco conocidos.
Estudios de genética molecular tempranas de desarrollo de la planta en su mayoría se basaban en técnicas tales como hibridación in situ y los reporteros GUS para analizar la expresión génica. Si bien estos métodos han proporcionado una gran cantidad de información y contribuido en gran medida a nuestra comprensión del crecimiento de las plantas y el desarrollo de flores, hay limitaciones importantes: carecen de buena resolución celular, no permita la fácil observación del patrón de expresión de múltiples genes en la misma muestras, y esto es importante, sólo pueden aplicarse a los tejidos muertos y fijos. Los recientes avances en microscopía confocal han superado estas limitaciones y proporcionar los biólogos del desarrollo de una herramienta poderosa para investigar los procesos de morfogénesis de plantas subyacente. En particular, la microscopía confocal permite la observación de los tejidos vivos y órganos a lo largo de su formación, que es critical para comprender plenamente un proceso esencialmente dinámico como el desarrollo.
De formación de imágenes confocal en vivo se ha usado ampliamente para analizar el crecimiento aéreas de las plantas y la producción de órganos laterales por el SAM (por ejemplo, Referencias 3, 4, 5, 6), pero con la excepción de unos pocos informes (por ejemplo, las referencias 7, 8, 9, 10), que no ha sido ampliamente aplicado al estudio de desarrollo de la flor. Los protocolos para la imagen confocal en vivo de la SAM están disponibles (por ejemplo, hace referencia a 11, 12), y proporcionan una buena base para la forma de la imagen de los botones de las flores en desarrollo que rodean el SAM. Sin embargo, los brotes de flor de imagen presenta retos específicos: por ejemplo,brotes de flor se convierten rápidamente en más grande que el SAM, y en la etapa 4, sépalos comenzar a cubrir las FM (etapas como se describe en la referencia 13), y de atenuación de la fluorescencia de los tejidos subyacentes (Figura 2A). A continuación, ofrecemos un protocolo detallado que explica cómo realizar la imagen confocal en vivo en el desarrollo de los brotes de flor de Arabidopsis utilizando un montante o un microscopio invertido y una lente de inmersión en agua. Hemos publicado anteriormente en este protocolo de referencia 14.
A continuación, ofrecemos un protocolo para la obtención de imágenes, el desarrollo de los brotes de flor de Arabidopsis en vivo con un microscopio confocal y una lente de inmersión en agua. Si bien esto se puede hacer, ya sea con un montante o un microscopio invertido, es más fácil y rápido de usar la antigua. También vale la pena señalar que los diferentes sistemas confocal varían significativamente en términos de velocidad, sensibilidad y capacidad de separar las longitudes de onda. Los mejores microscopio confocal permiten ahora a la imagen de varios canales diferentes (por ejemplo, GFP, YFP, dsRed y yoduro de propidio; Figura 2 g) en las mismas muestras. Algunos microscopio confocal están equipados con un detector espectral, que puede recoger la fluorescencia de varios fluoróforos simultáneamente y separarlos después. Cuando se utiliza un detector regular, sin embargo, un conjunto de láseres y filtros debe ser utilizado para excitar y separar la fluorescencia de diferentes fluoróforos. Algunos fluoróforos tienen espectros de emisión totalmente distinta (por ejemplo, una CFPd YFP), y se pueden obtener imágenes de forma simultánea. Otros fluoróforos tienen espectros de emisión que se superponen parcialmente (por ejemplo, GFP y YFP), y en general tienen que ser fotografiado por separado, lo que aumenta el tiempo de formación de imágenes. Imaging cercanos fluoróforos también a menudo requiere la restricción de la cantidad del espectro se recoge para cada canal para evitar la fluorescencia de un fluoróforo de las fugas en el otro canal. Esto provoca una pérdida de intensidad de la señal recogida, que puede ser compensada por un aumento de la potencia del láser y la ganancia. Sin embargo, el tiempo de proyección de imagen prolongada y una mayor potencia del láser pueden blanquear y / o dañar la muestra. El aumento de la potencia del láser y / o ganancia también pueden aumentar el ruido de fondo. Optimización de intensidad de la señal, la resolución y el tiempo de proyección de imagen para cada muestra se realiza a través de un proceso de ensayo y error, e implica permanentes compensaciones.
Este protocolo se explica cómo realizar la imagen confocal en vivo de los botones florales en desarrollo en los flancos de un ápice del brote diseccionado. EsoPuede argumentarse que el hecho de que el ápice del brote no está conectado al resto de la planta y crece en un medio que contiene citoquininas podrían afectar SAM y desarrollo de la flor. Sin embargo, este medio se diseñó empíricamente a través de un proceso de ensayo y error para asegurar el rodaje diseccionado meristemos apicales producen nuevos brotes de flores en el plastocrono normal, y que estos capullos de las flores se desarrollan normalmente 15. Del mismo modo, la disección sépalo no parece afectar los patrones de expresión de genes o el desarrollo del resto de la flor. Otros protocolos de detalle la forma de realizar la imagen confocal en vivo de la SAM todavía unido al resto de la planta (por ejemplo, referencia 11). Tales protocolos podrían adaptarse a, y ofrecen una alternativa útil para la obtención de imágenes de flores en desarrollo, sobre todo en el estudio de los procesos relacionados con citoquininas. Presentan varios inconvenientes, sin embargo: los tallo se alarga y giros, y cambia la orientación de los capullos de las flores; unnd mientras imágenes de un ápice del brote unido al resto de la planta funciona bien con un microscopio vertical, es mucho más complicado que hacerlo con un microscopio invertido.
Lentes de inmersión tienen una mejor apertura numérica (NA) que las lentes "secos" (es decir, las lentes que están separados de la muestra por el aire), y por lo tanto proporcionan una resolución más fina de la muestra, lo cual es crítico cuando se utiliza un microscopio confocal. El uso de una lente de inmersión en agua por lo tanto proporciona una mejor NA de una lente seca, mientras que la prevención de la ápice del brote de deshidratación durante el proceso de formación de imágenes. Mientras que la glicerina y lentes de petróleo tienen una AN aún mayor que las lentes de agua, que requieren el uso de un cubreobjetos, que es muy poco práctico con una muestra del tamaño de un ápice del brote, que también sigue creciendo durante los experimentos de lapso de tiempo. Dado el tamaño de las muestras (dependiendo de las etapas florales, las pilas pueden ser más de 150 m de espesor), también es importante la utilización de una lente con una distancia de trabajo larga. Utilizamos típicamente una lente de 20 o 40X con un NA de 1 y una distancia de trabajo de 1.7-2.5 mm.
Software microscopio confocal ofrece varias formas de visualizar datos confocal, incluyendo reconstrucciones tridimensionales (figura 2, B1, B2 y B4) y vistas rebanada (Figura 2, B3). Aunque las vistas tridimensionales más comúnmente utilizados son proyecciones de máxima intensidad de los Z-pilas confocal (Figura 2, B1 y B4), algunos software (por ejemplo ZEN y Imaris) también ofrecen vistas de transparencia que filtra la señal de las partes más profundas de la muestra (Figura 2, B2), que puede ser útil cuando se mira en procesos que tienen lugar, o genes expresados en, la capa epidérmica. La intensidad de señal puede ser codificado con un solo color (figura 2, B1), utilizando inte pixelnsity, o el uso de un código de color (Figura 2, B4).
imagen confocal en vivo no sólo ofrece información valiosa cualitativos en el desarrollo de flores, sino que también proporciona potencialmente biólogos del desarrollo con una gran cantidad de datos cuantitativos. Software diferente (por ejemplo Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permite la cuantificación del número o el volumen de células que expresan uno o varios reporteros, o el nivel de expresión de reportero en células diferentes. Dicho software también puede ser utilizado para llevar a cabo la segmentación de células automático, realizar un seguimiento de los linajes de células y cuantificar el crecimiento. Este software ofrece diferentes herramientas similares, pero también difiere en muchos aspectos. MARS-ALT y MorphoGraphX fueron diseñados específicamente para las plantas 15, 20, 21, a diferencia de Imaris unand Fiji. MorphoGraphX sólo permite la segmentación y análisis de la capa epidérmica, mientras que Imaris y MARS-ALT permiten la segmentación y el análisis de toda la muestra. Sin embargo, MARS-ALT requiere la formación de imágenes antes de la misma muestra desde tres ángulos diferentes 15, y Imaris sólo requiere una sola pila. El acceso a la información cuantitativa es fundamental para mejorar nuestra comprensión del desarrollo de la flor.
The authors have nothing to disclose.
El autor desea agradecer al Prof. Elliot M. Meyerowitz por su apoyo y comentarios sobre el manuscrito, así como Ann Lavanway en el Dartmouth College y el Dr. Andres Collazo en la Instalación de imágenes biológicas en Caltech, por su ayuda en la solución de problemas técnicos con el imagen confocal en vivo. El trabajo de Nathanaël Prunet es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud a través de subvención R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |