Живой конфокальной визуализации Развития Arabidopsis Цветы
概要
Живые изображения конфокальных обеспечивают биолог с мощным инструментом для изучения развития. Здесь мы представляем подробный протокол для живой конфокальной микроскопии развития Arabidopsis цветов.
Abstract
Изучение роста и развития растений уже давно полагались на экспериментальных методов с использованием мертвых, неподвижных тканей и не имеющих надлежащего клеточное разрешение. Последние достижения в области конфокальной микроскопии, в сочетании с развитием многочисленных флуорофоров, преодолели эти проблемы и открыли возможность изучить экспрессию нескольких генов одновременно, с хорошим ячеистым разрешением, в живых образцах. Живые изображения конфокальных обеспечивают биолог растений с мощным инструментом для изучения развития, и широко используются для изучения роста корней и формирования органов боковых на флангах апикальной меристемы побега. Тем не менее, он не был широко применяется для изучения развития цветка, отчасти из-за проблемы, которые являются специфическими для визуализации цветов, такие, как чашелистики, которые растут над цветочной меристемой и отфильтровать флуоресценцию от нижележащих тканей. Здесь мы представляем подробный протокол для выполнения конфокальной микроскопии живой в прямом эфире, развитие арабаidopsis бутоны, используя либо прямой или инвертированный микроскоп.
Introduction
Большая часть тела растений образует после зародыше из группы стволовых клеток, расположенных на или вблизи вершины – или апикальных меристем – побегов и корней. Все надземные структуры взрослых растений происходят из апикальной меристемы побега (SAM), который непрерывно производит боковые органы на флангах: листы в фазе вегетативной и цветочные меристемы (FMS) после перехода к репродуктивной фазе. Главы МИД, в свою очередь превратиться в цветы. В то время как Arabidopsis САМ производит органы боковой по одному за раз, в итерационном, спирали, Главы МИД производят четыре типа цветочных органов в течение четырех мутовках, в частично синхронным образом, с несколькими программами развития разгадке одновременно. Генетические сети , лежащие в основе спецификации идентичности различных цветочных органов были частично расшифрованы (обзоры, ссылки см 1, 2), но многие аспекты цветка developmeнт, например, цветочные позиционировании органа и определение границ между мутовками, по-прежнему плохо изучено.
Ранние молекулярные генетические исследования развития растений в основном полагались на методы , такие , как гибридизация и репортеров ВСО для анализа экспрессии генов в. Хотя эти методы предоставили огромное количество информации и внесли большой вклад в наше понимание роста и развитие растений цветка, существует серьезные ограничения: они не имеют хорошее клеточное разрешение, не позволяют легко наблюдение паттерна экспрессии нескольких генов в том же образцы, и, что важно, может быть применен только к мертвым, фиксированных тканей. Последние достижения в области конфокальной микроскопии преодолеть эти ограничения, а также обеспечить онтогенетики с мощным инструментом для исследования процессов, лежащий морфогенеза растений. В частности, конфокальной микроскопии позволяет для наблюдения живых тканей и органов на протяжении всей их формирования, что сritical полностью понять квинтэссенцию динамического процесса, как развитие.
Живые изображения конфокальных широко используются для анализа антенного роста растений и производства боковых органов со стороны SAM (например , ссылки 3, 4, 5, 6), но за исключением нескольких отчетов (например , ссылки 7, 8, 9, 10), он не был широко применяется для изучения развития цветка. Протоколы для живых конфокальной визуализации SAM доступны (например , ссылки 11, 12), а также обеспечить хорошую основу для того, как изображения развивающихся бутонов , которые окружают SAM. Тем не менее, цветочные почки изображения представлены конкретные задачи: например,цветочные почки быстро стать больше , чем САМ, а на этапе 4, чашелистики начать покрытие FM (этапы , как описано в ссылке 13), и регулировки яркости флуоресценции от нижележащих тканей (фиг.2А). Здесь мы приводим подробный протокол, объясняющие, как выполнять конфокальной микроскопии живой на развитие Arabidopsis бутонов, используя либо прямой или инвертированный микроскоп и водно-погружной объектив. Ранее мы опубликовали этот протокол в работе14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим протокол для визуализации живых, развивающегося Arabidopsis бутонов с конфокальной микроскопией и водой погружной линзой. В то время как это может быть сделано либо в вертикальном положении или инвертированный микроскоп, то проще и быстрее использовать прежний. Также стоит отметить, что различные системы конфокальной существенно различаются с точки зрения скорости, чувствительности и способности разделять длины волн. Лучшая конфокальная микроскопы теперь позволяет получать изображения несколько различных каналов (например , GFP, YFP, DsRed и пропидийиодид; фигура 2G) в тех же образцах. Некоторые конфокальные микроскопы оснащены спектральным детектором, который может собрать флуоресценции от нескольких флуорофоров одновременно и отделить их потом. При использовании обычного детектора, однако, множество лазеров и фильтров должно быть использовано для возбуждения и отделить флуоресценции от различных флуорофоров. Некоторые флуорофоры имеют полностью отчетливые спектры излучения (например , CFPд YFP), и могут быть отображены одновременно. Другие флуорофоры имеют частично перекрывающиеся спектры излучения (например , GFP и YFP), и обычно должны быть отображены отдельно, что увеличивает время формирования изображения. Воображение близка флуорофора также часто требует ограничения, сколько спектра собирают для каждого канала, чтобы предотвратить флуоресценции от одного флуорофоры от утечки в другой канал. Это приводит к потере интенсивности собранного сигнала, который может быть компенсирован увеличением мощности лазера и усиление. Однако продолжительное время формирования изображения и увеличение мощности лазера может отбеливать и / или привести к повреждению образца. Увеличение мощности лазера и / или усиления может также увеличить фоновый шум. Оптимизация интенсивности сигнала, разрешение и времени съемки для каждого образца осуществляется через процесс проб и ошибок, и включает в себя постоянные компромиссы.
Этот протокол объясняет, как выполнять живую конфокальную микроскопию цветочных почек, развивающиеся на флангах расчлененной верхушки побега. ЭтоМожно утверждать, что тот факт, что стрелять вершина не соединена с остальной частью растения и растет в среде, содержащей цитокинины могут повлиять на SAM и развитие цветка. Однако, эта среда была разработана эмпирически через процесс проб и ошибок , чтобы обеспечить расчлененный стрелять апикальной меристемы производят новые цветочные почки при нормальной plastochron, и что эти бутоны развиваются нормально 15. Точно так же, чашелистник рассечение не кажется, влияет на характер экспрессии генов или развитие остальной части цветка. Другие протоколы подробно , как выполнять живую конфокальную визуализацию SAM еще прикреплены к остальной части растений (например , ссылка 11). Такие протоколы могут быть адаптированы к, и предлагают полезную альтернативу для визуализации развития цветов, особенно при изучении процессов цитокинина связанных. Они представляют собой ряд недостатков, однако: стволовые удлиняются и изгибы, и изменяют ориентацию цветочных почек;го во время получения изображения всхода апекса, прикрепленный к остальной части растений хорошо работает с прямым микроскопом, это гораздо сложнее сделать это с помощью инвертированного микроскопа.
Погружные линзы имеют лучшую числовую апертуру (NA) , чем «сухие» линзы (то есть линзы, которые отделенны от образца на воздухе), и , следовательно , обеспечивают более высокое разрешение образца, которое имеет решающее значение при использовании конфокальной микроскопии. Использование воды погружение линз, таким образом, обеспечивает гораздо лучше, чем NA сухой линзы, при предотвращении верхушки побега из дегидратации во время процесса формирования изображения. В то время как глицерин и масляные линзы имеют еще более высокий, чем NA воды линзы, они требуют использования покровного, что очень непрактично с образцом размера с верхушкой побега, который также продолжает расти в течение покадровых экспериментов. С учетом размеров образцов (в зависимости от цветочных этапов, стеки может быть более 150 мкм), также важно, чтобы использовать объектив с большим рабочим расстоянием, Как правило, мы используем 20 или 40X объектив с NA 1 и рабочим расстоянием 1,7-2,5 мм.
Конфокальный микроскоп программное обеспечение предлагает несколько способов для визуализации данных конфокальной, в том числе трехмерных реконструкций (рис 2, B1, B2 и B4) и мнения среза (рис 2, B3). В то время как наиболее часто используемые трехмерные виды максимальные проекции интенсивности конфокальной Z-стеки (рис 2, B1 и B4), некоторые программы (например , ZEN и Imaris) открывается вид прозрачности , который отфильтровывает сигнал из более глубоких частей образец (рисунок 2, В2), которые могут быть полезны при взгляде на процессы , происходящие, или генов , выраженных в, эпидермальным слоем. Интенсивность сигнала может либо быть закодированы с помощью одного цвета (фиг.2, B1), используя пиксельный Intensity, или с использованием цветового кода (рисунок 2, B4).
Живые изображения конфокальных предлагает не только ценное качественное понимание развития цветка, он также потенциально обеспечивает онтогенетику с богатством количественных данных. Различное программное обеспечение (например , Imaris, Fiji, МАРС-АЛТ, MorphographX 15, 20, 21) позволяет для количественного определения количества или объема клеток , экспрессирующих один или несколько репортеров, или уровень экспрессии репортера в разных клетках. Такое программное обеспечение может также использоваться для выполнения автоматической сегментации клеток, отслеживать клеточные клоны и количественного роста. Это различное программное обеспечение предлагает аналогичные инструменты, но и во многом отличается. МАРС-АЛТ и MorphoGraphX были разработаны специально для растений 15, 20, 21, в отличие от Imaris ай Fiji. MorphoGraphX позволяет только для сегментации и анализа эпидермального слоя, в то время как Imaris и MARS-ALT позволяют сегментации и анализа всей выборки. Тем не менее, МАРС-ALT требует предварительных изображений одного и того же образец из трех различных углов 15, и Imaris требуется только один стек. Доступ к количественной информации имеет решающее значение для дальнейшего нашего понимания развития цветка.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор хотел бы поблагодарить проф Эллиот М. Мейерович за его поддержку, а также замечания по рукописи, а также Энн Лавануэй в Колледж Дартмут и д-р Андрес Кольясо на биологической визуализации Facility Калифорнийского технологического института за помощь в решении технических проблем, с живой конфокальной микроскопии. Работа Натанаел Прунет получает поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения через Грант R01 GM104244 к Эллиот M Майероуиц.
Materials
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
参考文献
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
