يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور
概要
يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء مع أداة قوية لدراسة التنمية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل عن التصوير متحد البؤر المباشر لتطوير الزهور نبات الأرابيدوبسيس.
Abstract
وقد اعتمدت الدراسة نمو النبات والتنمية طويلة على تقنيات تجريبية باستخدام الميتة والأنسجة الثابتة وتفتقر إلى قرار الخلوي السليم. التطورات الحديثة في الفحص المجهري متحد البؤر، جنبا إلى جنب مع تطوير العديد من fluorophores، والتغلب على هذه القضايا وفتح إمكانية لدراسة التعبير عن جينات عدة في وقت واحد، مع قرار الخلوي جيد، في عينات حية. يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء النباتية مع أداة قوية لدراسة التنمية، واستخدمت على نطاق واسع لدراسة نمو الجذور وتشكيل أجهزة الجانبية على الجناحين تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي. ومع ذلك، لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة تطوير زهرة، ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات التي تخص التصوير الزهور، مثل كأسية التي تنمو على النسيج الإنشائي زهرة، وتصفية مضان من الأنسجة الكامنة. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لأداء الحي التصوير متحد البؤر على الهواء مباشرة، وتطوير العربيةidopsis براعم الزهور، وذلك باستخدام إما تستقيم أو مجهر مقلوب.
Introduction
معظم جسم النبات يشكل بعد embryonically من مجموعات من الخلايا الجذعية تقع في أو بالقرب من الحافة – أو الخلايا الإنشائية قمية – من يطلق النار والجذور. جميع الهياكل فوق الأرض من النبات الكبار مستمدة من تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي (SAM)، التي تنتج بشكل مستمر أجهزة الجانبية على جنباته: يغادر خلال المرحلة الخضرية، والخلايا الإنشائية زهرة (وزراء الخارجية) بعد أن التحولات إلى المرحلة الإنجابية. وزراء خارجية بدورها تتطور إلى الزهور. في حين أن نبات الأرابيدوبسيس SAM تنتج أجهزة الجانبية واحد في كل مرة، في، ونمط دوامة متكررة، وزراء خارجية تنتج أربعة أنواع من الأعضاء الزهرية في غضون أربعة جدلات، بطريقة متزامنة جزئيا، مع البرامج التنموية متعددة يتفكك في وقت واحد. تم الشبكات الوراثية الكامنة وراء تحديد هوية الأعضاء الزهرية مختلفة فك شفرتها جزئيا (للاستعراض، انظر المراجع 1 و 2)، ولكن العديد من جوانب الإنمائية لل زهرةالإقليم الشمالي، مثل تحديد المواقع الجهاز الأزهار وتعريف الحدود بين جدلات، لا تزال غير مفهومة.
الدراسات الجينية الجزيئية الأولى من تطوير محطة تعتمد في الغالب على تقنيات مثل التهجين في الموقع وصحفيين المكتب المركزي للاحصاءات لتحليل التعبير الجيني. في حين أن هذه الطرق قد وفرت ثروة من المعلومات وساهمت في فهمنا لنمو النبات والتنمية زهرة إلى حد كبير، وهناك قيود هامة: أنها تفتقر إلى قرار الخلوي جيد، لا تسمح لمراقبة سهلة من نمط التعبير عن جينات متعددة في نفس العينات، والأهم من ذلك، يمكن أن ينطبق إلا على الميت الأنسجة الثابتة. والتغلب على التطورات الحديثة في الفحص المجهري متحد البؤر هذه القيود، وتوفير علماء البيولوجيا التطورية مع أداة قوية للتحقيق في العمليات الأساسية التشكل النبات. على وجه الخصوص، متحد البؤر المجهري يسمح لمراقبة الأنسجة والأعضاء الحية في جميع أنحاء تشكيلها، وهو جritical إلى فهم كامل عملية ديناميكية جوهري مثل التنمية.
وقد استخدم التصوير متحد البؤر الحية على نطاق واسع لتحليل نمو الجوي من النباتات وإنتاج أجهزة الجانبية من قبل SAM (على سبيل المثال يحيل الى 3، 4، 5، 6)، ولكن باستثناء عدد قليل من التقارير (مثل الإشارات 7، 8، 9، 10)، لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة تطوير زهرة. هي بروتوكولات التصوير متحد البؤر المباشر لSAM المتاحة (مثل يحيل الى 11، 12)، وتوفر قاعدة جيدة لكيفية صورة براعم الزهور النامية التي تحيط SAM. ومع ذلك، براعم الزهور التصوير تقدم تحديات محددة: على سبيل المثال،براعم الزهور تصبح بسرعة أكبر من SAM، وفي المرحلة 4، كأسية تبدأ تغطي FM (مراحل كما هو موضح في اشارة 13)، ويعتم مضان من وراء الأنسجة (الشكل 2A). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة تشرح كيفية تنفيذ الحية التصوير متحد البؤر على تطوير نبات الأرابيدوبسيس براعم الزهور باستخدام إما تستقيم أو مجهر مقلوب وعدسة المياه غمس. نشرنا سابقا هذا البروتوكول في اشارة 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتصوير الحية، وتطوير براعم زهرة نبات الأرابيدوبسيس مع المجهر متحد البؤر وعدسة المياه غمس. في حين أن هذا يمكن أن يتم إما تستقيم أو مجهر مقلوب، هو أسهل وأسرع لاستخدام السابق. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أنظمة متحد البؤر مختلفة تتفاوت تفاوتا كبيرا من حيث السرعة، والحساسية، والقدرة على فصل موجات. أفضل المجاهر متحد البؤر تسمح الآن إلى صورة عدة قنوات مختلفة (على سبيل المثال GFP، YFP، عن dsRed ويوديد propidium، الشكل 2G) في نفس العينات. وقد تم تجهيز بعض مجهر بؤري مع كشف الطيفي، والتي يمكن جمع مضان من عدة fluorophores في وقت واحد وفصلها بعد ذلك. عند استخدام جهاز كشف منتظم، إلا أن مجموعة من أجهزة الليزر والمرشحات يجب أن تستخدم لإثارة وفصل مضان من fluorophores مختلفة. بعض fluorophores لها أطياف الانبعاث واضح تماما (على سبيل المثال لCFPد YFP)، ويمكن تصوير في وقت واحد. fluorophores الأخرى لديها أطياف الانبعاث متداخلة جزئيا (على سبيل المثال GFP وYFP)، وعادة ما تحتاج للتصوير على حدة، مما يزيد من وقت التصوير. تصوير fluorophores وثيقة أيضا غالبا ما يتطلب تقييد كم من الطيف التي يتم جمعها لكل قناة لمنع مضان من fluorophore واحد من التسرب إلى قناة أخرى. هذا يؤدي إلى فقدان كثافة الإشارة التي تم جمعها، والتي يمكن أن تعوض زيادة في قوة الليزر واكتساب. ومع ذلك، لفترة طويلة وقت التصوير وزيادة قوة الليزر قد التبييض و / أو تلف العينة. زيادة قوة الليزر و / أو مكاسب قد يزيد أيضا من الضوضاء في الخلفية. يتم تعظيم الاستفادة من كثافة إشارة، قرار ووقت التصوير لكل عينة من خلال عملية التجربة والخطأ، وينطوي على المقايضات دائمة.
يشرح هذا البروتوكول كيفية إجراء التصوير متحد البؤر حية من براعم الزهور تطوير على الجناحين لقمة تبادل لاطلاق النار تشريح. هذاويمكن القول أن كون قمة تبادل لاطلاق النار غير متصل بقية النبات وينمو في المتوسط تحتوي على سيتوكينين قد تؤثر SAM والتنمية زهرة. ومع ذلك، تم تصميم هذه الوسيلة تجريبيا من خلال عملية التجربة والخطأ لضمان تبادل لاطلاق النار تشريح الخلايا الإنشائية قمية تنتج براعم الزهور الجديدة في فترة تتابع النمو الطبيعي، وأن هذه براعم الزهور تتطور عادة 15. وبالمثل، لا يظهر تشريح SEPAL أن تؤثر على أنماط التعبير الجيني أو تطوير ما تبقى من الزهور. البروتوكولات الأخرى بالتفصيل كيفية تنفيذ التصوير متحد البؤر المباشر لSAM لا تزال تعلق على بقية النباتات (مثل مرجع 11). ويمكن تكييف هذه البروتوكولات ل، وتقدم بديلا مفيدا للتصوير تطوير الزهور، وخاصة عند دراسة العمليات المتعلقة سيتوكينين. وهي تطرح عدة عيوب ولكن: ويستطيل الجذع والتقلبات، وتغيير اتجاه براعم الزهور. االثانية حين التصوير لقمة تبادل لاطلاق النار تعلق على بقية مصنع يعمل بشكل جيد مع المجهر تستقيم، هو أكثر تعقيدا بكثير للقيام بذلك مع مجهر مقلوب.
العدسات الغمر لها الفتحة العددية أفضل (NA) من العدسات "الجافة" (أي العدسات التي يتم فصلها من العينة عن طريق الجو)، وبالتالي توفر قرار أدق من العينة، وهو أمر حاسم عند استخدام المجهر متحد البؤر. باستخدام عدسة المياه غمس مما يوفر NA أفضل بكثير من عدسة الجافة، في حين منع قمة تبادل لاطلاق النار من التجفيف أثناء عملية التصوير. في حين الجليسرين والعدسات النفط لها NA حتى أعلى من العدسات الماء، وأنها تتطلب استخدام ساترة، وهو غير عملي جدا مع عينة حجم قمة تبادل لاطلاق النار، والتي تحافظ أيضا نموا خلال التجارب مرور الزمن. نظرا لحجم العينات (اعتمادا على مراحل الأزهار، ويمكن أن يكون أكوام أكثر من 150 ميكرون سميكة)، فمن المهم أيضا أن استخدام العدسات مع مسافة العمل الطويلة. ونحن عادة استخدام عدسة 20 أو 40X مع NA من 1 ومسافة العمل من 1،7-2،5 مم.
برنامج المجهر متحد البؤر يوفر عدة طرق لتصور البيانات متحد البؤر، بما في ذلك إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (الشكل 2، B1، B2 و B4) والآراء شريحة (الشكل 2، B3). في حين أن وجهات النظر الأكثر شيوعا ثلاثية الأبعاد هي أقصى التوقعات كثافة مبائر Z-مداخن (الشكل 2، B1 و B4)، بعض البرامج (مثل ZEN وImaris) تقديم وجهات النظر الشفافية التي بتصفية إشارة من أعمق أجزاء من العينة (الشكل 2، B2)، والتي يمكن أن تكون مفيدة عند النظر في العمليات التي تجري، أو الجينات التي أعرب عنها في وطبقة البشرة. كثافة إشارة إما أن تكون مشفرة مع لون واحد (الشكل 2، B1)، وذلك باستخدام بكسل الأسواق العالمية ضغطهاnsity، أو باستخدام رمز اللون (الشكل 2، B4).
يعيش التصوير متحد البؤر يوفر ليس فقط الأفكار النوعية قيمة في التنمية زهرة، كما أنه يحتمل أن يوفر علماء البيولوجيا التطورية مع ثروة من البيانات الكمية. برامج مختلفة (على سبيل المثال Imaris، فيجي، MARS-ALT، MorphographX 15، 20، 21) يسمح لتقدير عدد أو حجم الخلايا معربا عن واحد أو عدة صحفيين، أو على مستوى التعبير مراسل في خلايا مختلفة. ويمكن أيضا أن مثل هذه البرامج يمكن استخدامها لتنفيذ تجزئة الخلية التلقائي، وتتبع الأنساب الخلايا وقياس النمو. هذا البرنامج يقدم أدوات مختلفة مماثلة، ولكنه يختلف أيضا في نواح كثيرة. تم تصميم MARS-ALT وMorphoGraphX خصيصا للمحطات 15، 20، 21، على عكس Imaris لالثانية فيجي. MorphoGraphX يسمح فقط للتجزئة وتحليل طبقة البشرة، في حين Imaris وMARS-ALT تسمح للتجزئة وتحليل العينة كلها. ومع ذلك، MARS-ALT يتطلب التصوير مسبق من نفس العينة من ثلاث زوايا مختلفة 15، وImaris يتطلب سوى كومة واحدة. الوصول إلى المعلومات الكمية أمر بالغ الأهمية لزيادة فهمنا للتنمية زهرة.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلف أن أشكر البروفيسور إليوت M مييرويتز لدعمه، والتعليقات على المخطوطة، وكذلك آن لافانواي في كلية دارتموث والدكتور أندريس كولازو في مرفق البيولوجية التصوير في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا للمساعدة في حل المسائل التقنية مع التصوير متحد البؤر الحية. ويدعم عمل ناثانيال برونيت من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة من خلال منح R01 GM104244 إلى إليوت M مييرويتز.
Materials
| Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
| Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
| Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
| Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
| Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
| Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
| P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
| Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
| Laser ablation system | for sepal ablation | ||
| Laser scanning confocal microscope system | |||
| 20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
| Agarose | |||
| Sucrose | |||
| Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
| Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
| Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
| N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
| Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |
参考文献
- Prunet, N., Jack, T. P. Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs. Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).
- Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development. FEBS J. , (2016).
- Heisler, M. G., et al. Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).
- Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex. Science. 310 (5748), 663-667 (2005).
- Yadav, R. K., et al. WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex. Genes & Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).
- Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima. Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).
- Urbanus, S. L., et al. In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana. BMC Plant Biol. 9, (2009).
- Hong, L., et al. Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging. Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).
- Roeder, A. H., et al. Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana. PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).
- Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem. Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Dev. Biol. , (2016).
- Fernandez, R., et al. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. , (2010).
- Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).
- Irish, V. F., Sussex, I. M. Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development. Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).
- Vernoux, T., et al. The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex. Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Barbier de Reuille, P., et al. MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D. Elife. 4, 05864 (2015).
- Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX. Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).
