immagini dal vivo confocale offre biologi con un potente strumento per studiare lo sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia confocale in diretta di sviluppare Arabidopsis fiori.
Lo studio della crescita e dello sviluppo pianta è a lungo invocato tecniche sperimentali che utilizzano morti, tessuti fissati e prive di adeguata risoluzione cellulare. I recenti progressi nella microscopia confocale, in combinazione con lo sviluppo di numerosi fluorofori, hanno superato questi problemi e ha aperto la possibilità di studiare l'espressione di diversi geni contemporaneamente, con una buona risoluzione cellulare, in campioni dal vivo. vivo imaging confocale fornisce biologi vegetali con un potente strumento per studiare lo sviluppo, ed è stato ampiamente utilizzato per studiare la crescita delle radici e la formazione di organi laterali sui fianchi del meristema apicale. Tuttavia, non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore, in parte a causa di problemi che sono specifici per l'imaging fiori, come i sepali che crescono nel meristema fiore, e filtrare la fluorescenza da tessuti sottostanti. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per eseguire l'imaging confocale in diretta su Live, sviluppo araboidopsis boccioli, utilizzando sia un montante o un microscopio invertito.
La maggior parte del corpo pianta forma post-embrionalmente da gruppi di cellule staminali situate in corrispondenza o in prossimità della punta – o meristemi apicali – dei germogli e le radici. Tutte le strutture fuori terra della pianta adulta derivano dal meristema apicale (SAM), che produce continuamente organi laterali sui fianchi: foglie durante la fase vegetativa, e meristemi fiori (FM) dopo esso transizioni di fase riproduttiva. FM a loro volta sviluppano in fiori. Mentre l'Arabidopsis SAM produce organi laterali uno alla volta, in una, modello a spirale iterativo, FM producono quattro tipi di organi floreali all'interno quattro spirali, in modo parzialmente sincrono, con più programmi di sviluppo dipanando simultaneamente. Le reti genetici alla base della specifica l'identità dei diversi organi fiorali sono stati parzialmente decifrato (per le recensioni, vedi riferimenti 1, 2), ma molti aspetti del fiore SVILUPPOnt, come il posizionamento degli organi fiorali e la definizione dei confini tra spire, rimangono poco compreso.
I primi studi genetici molecolari di sviluppo delle piante si affida tecniche come l'ibridazione in situ e reporter GUS per analizzare l'espressione genica. Mentre questi metodi hanno fornito una ricchezza di informazioni e notevolmente contribuito alla nostra comprensione della crescita delle piante e lo sviluppo del fiore, ci sono delle limitazioni importanti: mancano di buona risoluzione cellulare, non consentono la facile osservazione del pattern di espressione di geni multipli nello stesso campioni, e soprattutto, possono essere applicati solo a tessuti morti, fissi. I recenti progressi nella microscopia confocale hanno superato questi limiti, e di fornire biologi dello sviluppo con un potente strumento per indagare i processi sottostanti morfogenesi impianto. In particolare, la microscopia confocale permette l'osservazione dei tessuti vivi ed organi durante la loro formazione, che è critical per comprendere appieno un processo tipicamente dinamico come sviluppo.
Vivo imaging confocale è stato ampiamente utilizzato per analizzare la crescita aerea delle piante e la produzione di organi laterali dal SAM (ad esempio fa riferimento 3, 4, 5, 6), ma con l'eccezione di alcuni rapporti (es riferimenti 7, 8, 9, 10), esso non è stato ampiamente applicato allo studio dello sviluppo del fiore. Protocolli per l'imaging confocale in diretta del SAM sono disponibili (ad esempio, fa riferimento 11, 12), e forniscono una buona base per come rappresentare il via di sviluppo boccioli di fiori che circondano la SAM. Tuttavia, boccioli di fiori di imaging presenta sfide specifiche: per esempio,boccioli diventano rapidamente più grande della SAM, e allo stadio 4, sepali iniziano coprendo le fasi FM (come descritto nel riferimento 13), e regolazione della fluorescenza da tessuti sottostanti (Figura 2A). Qui, forniamo un protocollo dettagliato che spiega come eseguire l'imaging confocale in diretta sullo sviluppo di boccioli di fiori di Arabidopsis utilizzando un montante o un microscopio invertito e una lente d'acqua-immersione. Abbiamo precedentemente pubblicato questo protocollo di riferimento 14.
Qui, forniamo un protocollo per l'imaging, in via di sviluppo boccioli di fiori dal vivo di Arabidopsis con un microscopio confocale e una lente d'acqua-immersione. Anche se questo può essere fatto sia con un montante o un microscopio invertito, è più facile e più veloce da usare al primo. È anche interessante notare che diversi sistemi confocale variano notevolmente in termini di velocità, sensibilità e capacità di separare lunghezze d'onda. I migliori microscopi confocali consentono ora di immagine diversi canali (per esempio GFP, YFP, DsRed e propidio ioduro; figura 2G) nei medesimi campioni. Alcuni microscopi confocali sono dotati di un rivelatore spettrale, che consenta di raccogliere la fluorescenza da diversi fluorocromi contemporaneamente e separarli successivamente. Quando si utilizza un rilevatore normale, tuttavia, una serie di laser e filtri deve essere utilizzato per eccitare e separare la fluorescenza da differenti fluorofori. Alcuni fluorofori sono completamente distinti spettri di emissione (es PCP und YFP), e può essere ripreso contemporaneamente. Altri fluorofori hanno spettri di emissione parzialmente sovrapposti (es GFP e YFP), e di solito devono essere ripreso separatamente, il che aumenta il tempo di imaging. Imaging chiudi fluorofori anche spesso richiede limitare la quantità di spettro viene raccolto per ciascun canale per impedire fluorescenza da un fluoroforo fuoriuscita in un altro canale. Ciò provoca una perdita di intensità del segnale raccolta, che può essere compensata da un aumento della potenza del laser e guadagno. Tuttavia, il tempo di imaging prolungato e una maggiore potenza laser possono candeggina e / o danneggiare il campione. Aumento della potenza del laser e / o aumento può anche aumentare il rumore di fondo. Ottimizzazione di intensità del segnale, la risoluzione e il tempo di imaging per ogni campione avviene attraverso un processo di tentativi ed errori, e coinvolge compromessi permanenti.
Questo protocollo spiega come eseguire l'imaging confocale in diretta di gemme a fiore in via di sviluppo sui fianchi di un apice germoglio sezionato. essopuò essere sostenuto che il fatto che l'apice riprese non è collegata al resto della pianta e cresce in un mezzo contenente citochinine possono incidere SAM e sviluppo del fiore. Tuttavia, questo mezzo è stato progettato empiricamente attraverso un processo di tentativi ed errori per assicurare le riprese sezionato meristemi apicali produrre nuovi boccioli di fiori al plastochron normale, e che questi boccioli di fiori si sviluppano normalmente 15. Allo stesso modo, la dissezione sepalo non sembra influenzare pattern di espressione genica o lo sviluppo del resto del fiore. Altri protocolli dettaglio come eseguire confocale vivo della SAM ancora attaccate al resto dell'impianto (ad esempio riferimento 11). Tali protocolli potrebbero essere adattati a, e offrono una valida alternativa per l'imaging sviluppare fiori, soprattutto quando si studiano processi citochinine legati. Essi presentano tuttavia diversi inconvenienti: si allunga staminali e torsioni, e cambia l'orientamento dei boccioli; unnd mentre l'imaging di un apice germoglio attaccato al resto della pianta funziona bene con un microscopio verticale, è molto più complicata di farlo con un microscopio invertito.
Lenti immersione hanno una migliore apertura numerica (NA) di lenti "a secco" (cioè lenti che sono separate dal campione mediante aria), e quindi fornire una risoluzione più fine del campione, che è fondamentale quando si usa un microscopio confocale. Utilizzando un obiettivo acqua immersione fornisce quindi una migliore NA di un obiettivo asciutto, evitando l'apice sparare da disidratazione durante il processo di imaging. Mentre glicerina, lenti olio hanno una ancora maggiore NA di lenti d'acqua, che richiedono l'uso di un vetrino, che è molto poco pratico con un campione delle dimensioni di un apice germoglio, che mantiene anche crescere durante gli esperimenti time-lapse. Date le dimensioni dei campioni (a seconda delle fasi floreali, pile possono essere più di 150 micron di spessore), è anche importante utilizzare un obiettivo con una lunga distanza di lavoro. Usiamo tipicamente una lente 20 o 40X con una NA di 1 e una distanza di lavoro di 1.7-2.5 mm.
Software microscopio confocale offre diversi modi per visualizzare i dati confocale, tra ricostruzioni tridimensionali (Figura 2, B1, B2 e B4) e viste fetta (Figura 2, B3). Mentre i più comunemente usati viste tridimensionali sono proiezioni di massima intensità di Z-stack confocale (Figura 2, B1 e B4), alcuni software (es ZEN e Imaris) offrono anche una vista trasparenza che filtra il segnale dalle parti più profonde della il campione (Figura 2, B2), che può essere utile quando si esaminano i processi che avvengono, o geni espressi in, strato epidermico. Intensità del segnale può essere sia codificato con un singolo colore (Figura 2, B1), utilizzando pixel intensity, oppure utilizzando un codice colore (Figura 2, B4).
immagini dal vivo confocale offre non solo preziose intuizioni qualitativi in sviluppo del fiore, ma anche potenzialmente fornisce biologi dello sviluppo con una ricchezza di dati quantitativi. Diversi software (es Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) permette di quantificare il numero o il volume di cellule che esprimono uno o più reporter, o il livello di espressione di un reporter in celle diverse. Tale software può essere utilizzato anche per eseguire la segmentazione delle cellule automatica, tracciare linee cellulari e quantificare la crescita. Questo software diverso offre strumenti simili, ma si differenzia anche in molti modi. MARS-ALT e MorphoGraphX stati progettati specificamente per piante 15, 20, 21, a differenza di un ImarisND Fiji. MorphoGraphX consente solo per la segmentazione e l'analisi dello strato epidermico, mentre Imaris e MARS-ALT consentono la segmentazione e l'analisi dell'intero campione. Tuttavia, MARS-ALT richiede la preventiva immagini dello stesso campione da tre diverse angolazioni 15, e Imaris richiede solo una singola pila. L'accesso a informazioni quantitative è fondamentale per la nostra comprensione dello sviluppo del fiore.
The authors have nothing to disclose.
L'autore desidera ringraziare il Prof. Elliot M. Meyerowitz per il suo sostegno, e commenti sul manoscritto, così come Ann Lavanway al Dartmouth College e il Dr. Andres Collazo alla struttura di imaging biologico al Caltech per il loro aiuto nella risoluzione di problemi tecnici con il confocale vivo. Il lavoro di Nathanaël Prunet è sostenuto dal National Institutes of Health di Grant attraverso R01 GM104244 a Elliot M. Meyerowitz.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |