治療用抗体の実験室規模の産生および精製

治療用抗体の成功は、次世代の治療薬の波が開始されるように、抗体の開発に多額の投資を駆動し続けます。抗体市場は良好な特性⁴を有する抗体断片^1、抗体-薬剤コンジュゲート^2、二重特異性抗体³と操作された抗体により再形成されることが期待されます。医薬品の関心を集めて別のクラスは、バイオシミラーです。バイオシミラーの抗体は、すでに規制当局の承認を受けている治療用抗体の製品を複製する「高度に類似」しています。提案されたバイオシミラーは、その構造、機能、動物の毒性、臨床安全性と有効性、人間の薬物動態（PK）、薬力学（PD）および免疫原性^5、6に関して創始抗体と同等でなければなりません。

承認rをバイオシミラーの抗体のATEは、製品の最終品質に厳しい制約のために遅れています。このような最終処理工程に至る細胞株及び培養条件の特定等の正確な製造プロセスは、独自のままであり得ます。詳細は何ですか、抗体の製造は、本質的に非常に類似した製品を製造するの挑戦に追加できる変動率を伴います。総合的な物理化学的および生物物理学的特徴との比較は非常に困難である、まだバイオシミラー抗体の特性を実証する多くの研究が文献^7、8、9に浮上しています。

治療用抗体の生成は、それぞれの抗体のための遺伝子を保持するベクターを哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションから始まります。ベクター設計、細胞株および培養条件は、元の設定に重要な考慮事項でありますPRESSIONシステム。

抗体のDNA配列は、特許を含む医薬品銀行（www.drugbank.ca）、IMGT（www.igmt.org）や研究出版物から供給することができます。例えば、トラスツズマブのシーケンスは、医薬品銀行（：DB00072 DB ID）を介して利用可能です。可変領域のアミノ酸配列は、所望の宿主種における合成のための遺伝子の設計及び最適化を行うことができます。それは修飾アミノ酸配列に対して行われていないバイオシミラー抗体のために重要です。合成された後、抗体遺伝子を選択した適当なベクターにサブクローニングすることができます。

ヒトIgG抗体は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖からなります。両鎖の密調節された発現は、哺乳動物細胞¹⁰における異種IgGタンパク質の最適な生産に不可欠です。鎖間ジスルフィド結合を形成する必要があり、翻訳後修飾の数であることを持っているだけでなく、イントラタンパク質生合成の間にtroduced。ベクトルの数は、抗体遺伝子を（材料の表を参照）を発現するように設計されていますが利用可能です。これらの抗体に特異的ベクターは、通常、それぞれの鎖のように可変領域のみがクローニングを必要とする重鎖及び軽鎖の双方のための定常領域を発現します。

二つの独立した構築物（コトランスフェクション）を用いた細胞のトランスフェクションは、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を送達するための最も一般的なアプローチです。すなわち、各遺伝子は、それ自身のプロモーターにより駆動され、小胞体に組み立てられる前に、別個の抗体鎖として転写されます。一方、多シストロン性ベクターは、mRNA ¹¹の内部領域から許可翻訳有する単一のmRNA転写物として複数の遺伝子の発現を可能に組み込まれた内部リボソーム侵入部位（IRES）要素を有します。この例では、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子はARRANGに接続されています両方の抗体鎖^10、12の同時発現を達成するement。

一過性にトランスフェクトされた細胞は、実験の限られた数を実行するのに十分なタンパク質を得ながら、ゲノム組込みのための選択を受けた安定にトランスフェクトされた細胞株は、高い収率を提供できます。より高いタンパク質の量は、in vitroでの特徴付けに関連するアッセイ開発を可能にし、そのようなクローン細胞株とリード候補の選択などの下流の用途を考慮して、抗体の質の指標を提供することができます。

この記事の目的は、哺乳動物発現系において産生さ治療抗体の安定な発現および精製を記載することです。実際、この方法は、バイオシミラーの抗体の発現に適用することができます。この方法は、時間がかかりSTEいえ、重要へ進む前に、抗体の最初の特徴付けのために使用することができますより大規模な製造のための望ましいクローンを同定するPS。また、この方法は、他のタンパク質だけでなく、抗体を発現するために使用することができます。

以下の詳細なプロトコルは、治療用抗体トラスツズマブの発現を記載します。これは、自動化されたクロマトグラフィー法によってHEK-293細胞株と抗体タンパク質の精製における安定なトランスフェクションに続いてベクターDNAの調製から成ります。