Laboratorio scala di produzione e purificazione di un anticorpo terapeutico

Il successo di anticorpi terapeutici continua a guidare notevoli investimenti nello sviluppo di anticorpi come un'onda di terapie di nuova generazione ha inizio. Il mercato degli anticorpi dovrebbe essere rimodellato da frammenti di anticorpi ^1, anticorpo-farmaco coniugati ^2, anticorpi bispecifici ³ e anticorpi ingegnerizzati con proprietà favorevoli ^4. Un'altra classe guadagnando interesse farmaceutico sono biosimilari. Gli anticorpi biosimilari sono 'molto simile' replicare i prodotti di un anticorpo terapeutico che ha già ricevuto l'approvazione normativa. Un biosimilare proposto deve essere comparabile con l'anticorpo creatore rispetto alla sua struttura, la funzione, la tossicità animale, la sicurezza e l'efficacia clinica, la farmacocinetica umani (PK), farmacodinamica (PD) e l'immunogenicità ^{5, 6.}

L'approvazione RAtes di anticorpi biosimilari sono stati lenti a causa dei rigidi vincoli sulla qualità finale del prodotto. I processi di produzione esatte, come linee cellulari e condizioni di coltura specifici attraverso le fasi di lavorazione finali possono rimanere proprietaria. Inoltre, la produzione di anticorpi comporta intrinsecamente una certa variabilità che può aggiungere alla sfida di produrre un prodotto altamente simile. Una caratterizzazione fisico-chimiche e biofisica completa e il confronto è abbastanza difficile, ma una serie di studi che dimostrano le caratteristiche di anticorpi biosimilari stanno emergendo nella letteratura ^{7, 8, 9.}

Generazione di un anticorpo terapeutico inizia con la trasfezione di cellule ospiti di mammifero con un vettore che trasporta i geni per il rispettivo anticorpo. disegno vettoriale, condizioni della linea e di coltura cellulare sono considerazioni chiave per la creazione di exsistema di pressione.

Le sequenze di DNA di anticorpi possono essere di provenienza da Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o pubblicazioni di ricerca, tra cui brevetti. Ad esempio, la sequenza di trastuzumab è disponibile attraverso Drug Bank (DB ID: DB00072). La sequenza aminoacidica delle regioni variabili può subire Gene design e di ottimizzazione per la sintesi nella specie ospite desiderati. E 'importante per un anticorpo biosimilare che nessuna modifica è finalizzata sequenza amminoacidica. Una volta sintetizzato, geni anticorpali possono essere subclonate nel caso vettore di scelta.

anticorpi IgG umane sono costituite da due catene pesanti identiche e due catene leggere identici. Espressione strettamente regolata entrambe le catene è essenziale per la produzione ottimale di proteine IgG eterologa in cellule di mammifero ^10. Intra nonché legami disolfuro inter-catena deve essere formato e una serie di modificazioni post-traduzionali devono essere introdotti durante biosintesi delle proteine. Un certo numero di vettori sono disponibili che sono stati progettati specificamente per esprimere geni anticorpali (fare riferimento alla tabella dei materiali). Questi vettori specifici anticorpi di solito esprimono le regioni costanti per catene sia pesanti e leggere in modo che solo le regioni variabili di ogni catena richiedono clonazione.

Trasfezione delle cellule con due costrutti indipendenti (co-trasfezione) è l'approccio più comune per la distribuzione di geni pesanti e leggeri a catena-codifica. Cioè, ogni gene è azionato da un proprio promotore e trascritto come catene anticorpali separati prima di essere assemblato nel reticolo endoplasmatico. D'altra parte, vettori multi-cistronic hanno elementi interni voce sito ribosoma (IRES) incorporate che consentono l'espressione di geni multipli come un singolo mRNA trascritto con traduzione consentita dalle regioni interne del mRNA ^11. In questo esempio, i geni pesanti e leggere catena codificanti sono accoppiati in un arrangement per ottenere co-espressione di entrambe le catene di anticorpi ^{10, 12.}

Mentre le cellule trasfettate producono proteine ​​sufficiente per eseguire un numero limitato di esperimenti, linee cellulari stabilmente transfettate che sono sottoposti a selezione per l'integrazione del genoma possono fornire rese più elevate. Importi proteico superiore consentono sviluppo di saggi relativi alla caratterizzazione in vitro e possono fornire un'indicazione della qualità anticorpi in considerazione per applicazioni a valle come linea cellulare clonale e selezione dei candidati piombo.

L'obiettivo di questo articolo è descrivere l'espressione stabile e purificazione di un anticorpo terapeutico prodotta in un sistema di espressione di mammifero. Infatti, questo metodo può essere applicato per l'espressione di un anticorpo biosimilare. Il metodo può essere utilizzato per la caratterizzazione iniziale di anticorpi prima di procedere alla critica, seppur ste tempops di identificare un clone auspicabile per ingrandire fabbricazione scala. Inoltre, questo metodo può essere usato per esprimere altre proteine ​​e non solo anticorpi.

Il seguente protocollo dettagliato descrive l'espressione di terapeutica trastuzumab anticorpi. Questa consiste nella preparazione del DNA vettoriale seguita da trasfezione stabile in cellule HEK-293 e purificazione di proteine ​​anticorpi con un metodo cromatografico automatizzato.