Pluripotenti cellule staminali derivate cellule cardiache per la riparazione del miocardio
概要
Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.
Abstract
Le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) devono essere completamente in tipi cellulari specifici prima della somministrazione, ma i protocolli convenzionali per differenziare hiPSCs in cardiomiociti (hiPSC-CMS), cellule endoteliali (hiPSC-ECS), e cellule muscolari lisce (SMC) sono spesso limitata dalla bassa resa, la purezza, e / o di scarsa stabilità fenotipica. Qui, presentiamo protocolli innovativi per generare hiPSC-CM, -ECs e -SMCs sostanzialmente più efficiente rispetto ai metodi convenzionali, come pure un metodo per combinare iniezione di cellule con una patch citochina contenente creato sul sito di somministrazione. La patch migliora sia la conservazione delle cellule iniettate, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule vengano spremuto fuori del miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo prolungato. In un modello suino di infarto del danno da ischemia-riperfusione, il tasso di attecchimento è stato più di due volte maggiore quando lacellule sono state somministrate con la patch citochina contenente confronto alle cellule senza patch, e il trattamento con entrambe le celle e la patch, ma non solo con le cellule, è stato associato a miglioramenti significativi nella funzione cardiaca e dimensioni dell'infarto.
Introduction
cellule staminali pluripotenti umane indotta (hiPSCs) sono tra gli agenti più promettenti per la terapia cellulare rigenerativa perché possono essere differenziati in una gamma potenzialmente illimitato e quantità di cellule che non sono rifiutato dal sistema immunitario del paziente. Tuttavia, la loro capacità di auto-replicazione e differenziazione può anche portare alla formazione di tumori e, di conseguenza, hiPSCs bisogno di essere completamente differenziate in tipi cellulari specifici, come i cardiomiociti (CMS), cellule endoteliali (ECS), e le cellule muscolari lisce (SMC ), prima della somministrazione. Uno dei metodi più semplici e più comuni di somministrazione delle cellule è iniezione intramiocardico diretta, ma il numero di cellule trapiantate che sono innestato dal tessuto miocardico nativo è eccezionalmente bassa. Gran parte di questo attrito può essere attribuito per l'ambiente citotossico del tessuto ischemico; tuttavia, quando le cellule staminali embrionali murine (CES) sono state iniettate direttamente nel miocardio di cuori illesi, oolo ~ 40% dei 5 milioni di cellule consegnati sono stati conservati per 3-5 ore 1, il che suggerisce che una parte sostanziale delle cellule somministrate usciti dal sito di somministrazione, forse perché sono stati espulsi attraverso il percorso dell'ago dalle alte pressioni prodotte durante contrazione del miocardio.
Qui, vi presentiamo nuovi metodi e sostanzialmente più efficienti per la generazione di cardiomiociti hiPSC-derivati (hiPSC-CMS) 2, le cellule endoteliali (hiPSC-ECS) 3, e cellule muscolari lisce (SMC) 4. In particolare, questo protocollo hiPSC-SMC è il primo a simulare la vasta gamma di caratteristiche morfologiche e funzionali osservate in somatica SMCs 5 indirizzando le cellule verso un fenotipo prevalentemente sintetico o contrattile SMC. Forniamo anche un metodo di consegna cellula che migliora il tasso di attecchimento di cellule iniettate creando una citochina contenente fibrina pATCH sul sito di iniezione. Il cerotto sembra migliorare sia la ritenzione cellulare, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule dalla esistente miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo di almeno tre giorni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migliorata la resa / purezza di hiPSC-CMS
protocolli convenzionali per differenziare le cellule staminali umane in CM sono spesso limitati da una bassa resa e la purezza; per esempio, solo 35-66% di hESC-CM ottenuto tramite Percoll separazione e la formazione del corpo cardiaco espresso lento catena pesante della miosina o cTnT 6. La purezza delle popolazioni hiPSC-CM differenziate può essere sostanzialmente aumentata selezionando per l'espressione di un gene report…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Materials
| Protocol 1 | |||
| mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
| Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
| Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
| B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
| RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
| BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
| bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
| 6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
| 10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
| Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
| Materials | Company | Catalog Number | コメント |
| Protocol 2 | |||
| Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
| EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
| VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
| EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
| TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
| EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
| SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
| CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
| CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
| Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
| Materials | Company | Catalog Number | コメント |
| Protocol 3 | |||
| CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
| PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
| Materials | Company | Catalog Number | コメント |
| Protocol 4 | |||
| Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| IGF | R&D | 291-G1-01M | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
| Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
| Materials | Company | Catalog Number | コメント |
| Protocol 5 | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
 -aminocaproic acid |
Sigma-Aldrich | A0420000 | |
| MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
| Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
| Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
| Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
| 1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
| 7T MRI | Siemens | 10018532 | |
| Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
| 2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
| 3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
| 3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |
参考文献
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