我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。
ヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs)が完全に投与する前に、特定の細胞型に分化されなければならないが、心筋細胞(hiPSC-CMS)にhiPSCsを区別するための従来のプロトコル、内皮細胞(hiPSC-ECS)、および平滑筋細胞(平滑筋細胞)は、しばしば低収量、純度、および/または貧弱な表現型の安定性によって制限されます。ここで、我々は、新規hiPSC-のCMを生成するためのプロトコル、-ECs、実質的に従来の方法よりも効率的です-SMCs、ならびに投与のサイト上で作成されたサイトカインを含むパッチで細胞注入を組み合わせるための方法を提示します。パッチは、長期間にわたってインスリン様成長因子(IGF)を放出することにより、心筋から絞り出されてから細胞を防ぐために、針の軌道、及び細胞生存を封止することにより、注入された細胞の保持の両方を改善します。心筋虚血再灌流傷害のブタモデルにおいて、生着率が時より2倍大きかったです細胞は、細胞とパッチの両方を有するサイトカイン含有貼付せずに細胞に比べ、パッチ、および治療を投与したが、一人ではない細胞を用いて、心機能および梗塞サイズの大幅な改善と関連していました。
ヒトの人工多能性幹細胞(hiPSCs)は、患者の免疫系によって拒絶されていない細胞の潜在的に無限の範囲と量に分化させることができるので、再生細胞療法のための最も有望な薬剤の一つです。 (平滑筋細胞を但し、自己複製および分化のための能力はまた、腫瘍形成につながる可能性があり、その結果、hiPSCsは、完全にこのような心筋細胞(CMS)、内皮細胞(EC)、および平滑筋細胞などの特定の細胞型に分化することが必要)、投与前。細胞投与の最も簡単で最も一般的な方法の1つは、直接心筋内注射であるが、本来の心筋組織により生着された移植細胞の数が非常に低いです。このスレの多くは、虚血組織の細胞毒性環境に起因することができます。しかし、マウスの胚性幹細胞(ESC)は、O、無傷心臓の心筋に直接注入しました。NLY〜配信500万細胞の40%は、それらが中に製造された高圧力によって針トラックを通って絞り出されたせいか、投与された細胞のかなりの割合は、投与部位を終了したことを示唆している3-5時間1、のために保持しました心筋収縮。
ここでは、(SMCの)4 hiPSC由来の心筋細胞(hiPSC-CMS)2、内皮細胞(hiPSC-ECS)3、および平滑筋細胞を生成するための新規かつ、実質的に、より効率的な方法を提示します。注目すべきは、このhiPSC-SMCプロトコルは、主に合成または収縮SMC表現型に向かって細胞を向けることによって、体細胞のSMC 5で観察された形態学的および機能的特性の広い範囲を模倣する最初のものです。我々はまた、サイトカインを含むフィブリンPを作成することにより、注入された細胞の生着率を改善細胞送達の方法を提供します注射部位の上にATCH。パッチは、少なくとも3日間の期間にわたってインスリン様成長因子(IGF)を放出することにより、心筋から出るセルを防止する針トラック、及び細胞生存を封止することにより、両方の細胞保持を改善するように見えます。
hiPSC-のCMの歩留まりの向上/純度
CMSにヒト幹細胞を分化するための従来のプロトコルは、多くの場合、低い収率および純度によって制限されます。例えば、ヒトES細胞-CMSのわずか35から66まで%は遅いミオシン重鎖またはcTnTの6を表明パーコール分離および心臓体形成を介して得られます。分化hiPSC-CM集団の純度は、実質的にCM特異的タンパク質<s…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).
Protocol 1 | |||
mTeSR1 medium | Stem cell technologies | 5850 | |
Growth-factor-reduced matrigel | Corning lifescience | 356231 | |
Y-27632 | Stem cell technologies | 72304 | |
B27 supplement, serum free | Fisher Scientific | 17504044 | |
RPMI1640 | Fisher Scientific | 11875-119 | |
Activin A | R&D | 338-AC-010 | |
BMP-4 | R&D | 314-BP-010 | |
bFGF | R&D | 232-FA-025 | |
Collagenase IV | Fisher Scientific | NC0217889 | |
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) | Fisher Scientific | 14175079 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10438018 | |
6-well plate | Corning Lifescience | 356721 | |
10cm dish | Corning Lifescience | 354732 | |
Cell incubator | Panasonic | MCO-18AC | |
Materials | Company | Catalog Number | コメント |
Protocol 2 | |||
Versene | Fisher Scientific | 15040066 | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F8630-5g | |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7009-1KU | |
EMB2 medium | Lonza | CC-3156 | |
VEGF | ProSpec-Tany | CYT-241 | |
EPO | Life Technologies | PHC9431 | |
TGF-ß | Peprotech | 100-21C | |
EGM2-MV medium | Lonza | CC-4147 | |
SB-431542 | Selleckchem | S1067 | |
CD31 | BD Bioscience | BDB555445 | |
CD144 | BD Bioscience | 560411 | |
15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 12565269 | |
Eppendorff Centrifuge | Eppendorf | 5702R | |
Materials | Company | Catalog Number | コメント |
Protocol 3 | |||
CHIR99021 | Stem cell technologies | 720542 | |
PDGF-ß | Prospec | CYT-501-10ug | |
Materials | Company | Catalog Number | コメント |
Protocol 4 | |||
Olive oil | Sigma-Aldrich | O1514 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
IGF | R&D | 291-G1-01M | |
Bovine serum albumin | Fisher Scientific | 15561020 | |
Heating plate | Fisher Scientific | SP88850200 | |
Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10Q | |
Materials | Company | Catalog Number | コメント |
Protocol 5 | |||
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 223506 | |
-aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A0420000 | |
MEM medium | Fisher Scientific | 12561-056 | |
Syringe | Fisher Scientific | 1482748 | |
Anesthesia ventilator | Datex-Ohmeda | 47810 | |
Anesthesia ventilator | Ohio Medical | V5A | |
Defibrillator | Physiol Control | LIFEPAK 15 | |
1.5T MRI | General Electric | Signa Horizon LX | |
7T MRI | Siemens | 10018532 | |
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) | Berlex | 50419-188-02 | |
2-0 silk suture | Ethilon | 685H | |
3-0 silk suture | Ethilon | 622H | |
3-0 monofilament suture | Ethilon | 627H |