概要

المحفزة الخلايا الجذعية المشتقة خلايا القلب لإصلاح عضلة القلب

Published: February 03, 2017
doi:

概要

نقدم ثلاثة بروتوكولات جديدة وأكثر كفاءة للتمييز الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان إلى العضلية، والخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء وطريقة التسليم أن يحسن engraftment من الخلايا المزروعة عن طريق الجمع بين حقن الخلايا مع بوساطة التصحيح تسليم خلوى.

Abstract

الناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) يجب أن تكون متمايزة تماما في أنواع معينة من الخلايا قبل الإدارة، ولكن البروتوكولات التقليدية للتمييز hiPSCs إلى العضلية (hiPSC-CMS)، والخلايا البطانية (hiPSC-ECS)، وخلايا العضلات الملساء (SMCS) غالبا ما تكون محدودة بسبب العائد المنخفض، والنقاء، و / أو ضعف الاستقرار المظهرية. هنا، نقدم بروتوكولات جديدة لتوليد hiPSC-مضادة، -ECs، و-SMCs التي هي إلى حد كبير أكثر كفاءة من الطرق التقليدية، فضلا عن طريقة للجمع بين حقن الخلايا مع التصحيح التي تحتوي على خلوى تم إنشاؤها على موقع الإدارة. التصحيح يحسن كلا من الإبقاء على حقن الخلايا، بإغلاق الطريق إبرة لمنع الخلايا من طرده من عضلة القلب، وبقاء الخلية، عن طريق الإفراج عن عامل النمو الذي يشبه الانسولين (IGF) على مدى فترة ممتدة. في نموذج الخنازير من عضلة القلب إصابة نقص التروية، ضخه، كان معدل engraftment أكثر من شقين أكبر عندماكانت تدار الخلايا مع التصحيح التي تحتوي على خلوى مقارنة مع الخلايا دون التصحيح، والمعاملة مع كل من الخلايا والتصحيح، ولكن ليس مع الخلايا وحدها، كان مرتبطا مع تحسينات كبيرة في وظيفة القلب وحجم احتشاء.

Introduction

الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي من بين العوامل الواعدة لعلاج الخلايا على التجدد لأنها يمكن أن تكون متباينة في مجموعة ويحتمل أن تكون غير محدودة وكمية من الخلايا التي لا يرفضها الجهاز المناعي للمريض. ومع ذلك، قدرتها على النسخ المتماثل الذات والتمايز يمكن أن يؤدي أيضا إلى تشكيل الورم، وبالتالي تحتاج إلى أن تكون متمايزة تماما في أنواع معينة من الخلايا، مثل العضلية (CMS)، والخلايا البطانية (ECS)، وخلايا العضلات الملساء hiPSCs (SMCS )، قبل الإدارة. واحد من أبسط والأكثر شيوعا أساليب إدارة الخلية هو حقن داخل عضلة القلب مباشرة، ولكن عدد الخلايا المزروعة التي المغروسة من قبل الأنسجة القلبية المحلية منخفضة بشكل استثنائي. الكثير من هذا الاستنزاف يمكن أن يعزى إلى البيئة السامة للخلايا الأنسجة الدماغية. ومع ذلك، عندما كانت الفئران الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) حقنها مباشرة في عضلة القلب من قلوب لم يصب، سنلي ~ 40٪ من 5 ملايين الخلايا تسليمها تم الاحتفاظ لمدة 3-5 ساعة مما يشير إلى أن نسبة كبيرة من الخلايا تدار خرجت موقع الإدارة، ربما لأنهم يحرمونهم من خلال المسار الإبرة من الضغوط العالية التي تنتج أثناء تقلص عضلة القلب.

هنا، فإننا نقدم طرق جديدة وإلى حد كبير أكثر كفاءة لتوليد العضلية المستمدة hiPSC (hiPSC-CMS) والخلايا البطانية (hiPSC-ECS) وخلايا العضلات الملساء (SMCS) 4. والجدير بالذكر أن هذا البروتوكول hiPSC-SMC هو اول محاولة لتقليد مجموعة واسعة من الخصائص المورفولوجية والوظيفية لوحظ في الجسدية SMCS 5 عن طريق توجيه الخلايا نحو SMC النمط الظاهري في الغالب الاصطناعية أو مقلص. ونحن نقدم أيضا وسيلة لتسليم خلية التي تعمل على تحسين معدل engraftment من حقن الخلايا عن طريق إنشاء التي تحتوي على خلوى الفيبرين صatch على موقع الحقن. ويبدو أن التصحيح لتحسين كل من الاحتفاظ خلية عن طريق ختم المسار إبرة لمنع الخلايا من الخروج من عضلة القلب، وبقاء الخلية، عن طريق الإفراج عن عامل النمو الذي يشبه الانسولين (IGF) على مدى ثلاثة أيام على الأقل.

Protocol

يتم تنفيذ كافة الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية الحيوان من جامعة ألاباما في برمنغهام. 1. التفريق hiPSCs إلى hiPSC-مضادة معطف الآبار من لوحة 6 جيدا مع انخفاض النمو عامل تبريد ق?…

Representative Results

توصيف متباينة hiPSC-مضادة، -ECs، و-SMCs القدرة التفاضلية للhiPSCs قيمت 2، 3، 4. تدفق تحليل الخلوي من التروبونين القلبي T التعبير (cTnT) تشير الى ان نقاوة السك…

Discussion

تحسين الإنتاجية / الطهارة من hiPSC-مضادة

البروتوكولات التقليدية للتمييز الخلايا الجذعية البشرية في مضادة غالبا ما تكون محدودة بانخفاض المحصول والنقاء. على سبيل المثال، فقط 35-66٪ من HESC-مضادة الحصول عليها عن طريق فصل Percoll وتشكيل هيئة ال…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by US Public Health Service grants NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, and UO1 HL100407-project 4 (to JZ), an American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) and a Research Voucher Award from University of Alabama at Birmingham Center for Clinical and Translational Science (to WZ).

Materials

Protocol 1
mTeSR1 medium Stem cell technologies 5850
Growth-factor-reduced matrigel Corning lifescience 356231
Y-27632 Stem cell technologies 72304
B27 supplement, serum free Fisher Scientific 17504044
RPMI1640 Fisher Scientific 11875-119
Activin A R&D 338-AC-010
BMP-4 R&D 314-BP-010
bFGF R&D 232-FA-025
Collagenase IV Fisher Scientific NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous) Fisher Scientific 14175079
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10438018
6-well plate Corning Lifescience 356721
10cm dish Corning Lifescience 354732
Cell incubator Panasonic MCO-18AC
Materials Company Catalog Number コメント
Protocol 2
Versene Fisher Scientific 15040066
Fibrinogen Sigma-Aldrich F8630-5g
Thrombin Sigma-Aldrich T7009-1KU
EMB2 medium Lonza CC-3156
VEGF ProSpec-Tany CYT-241
EPO Life Technologies PHC9431
TGF-ß Peprotech 100-21C
EGM2-MV medium Lonza CC-4147
SB-431542 Selleckchem S1067
CD31 BD Bioscience BDB555445
CD144 BD Bioscience 560411
15 mL centrifuge tube Fisher Scientific 12565269
Eppendorff Centrifuge Eppendorf 5702R
Materials Company Catalog Number コメント
Protocol 3
CHIR99021 Stem cell technologies 720542
PDGF-ß Prospec CYT-501-10ug
Materials Company Catalog Number コメント
Protocol 4
Olive oil Sigma-Aldrich O1514
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
Acetone Sigma-Aldrich 179124
Ethanol Fisher Scientific BP2818100
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882
Glycine Sigma-Aldrich G8898
IGF R&D 291-G1-01M
Bovine serum albumin Fisher Scientific 15561020
Heating plate Fisher Scientific SP88850200
Water bath Fisher Scientific 15-462-10Q
Materials Company Catalog Number コメント
Protocol 5
CaCl2 Sigma-Aldrich 223506
ezh-aminocaproic acid Sigma-Aldrich A0420000
MEM medium Fisher Scientific 12561-056
Syringe Fisher Scientific 1482748
Anesthesia ventilator Datex-Ohmeda 47810
Anesthesia ventilator Ohio Medical V5A
Defibrillator Physiol Control LIFEPAK 15
1.5T MRI General Electric Signa Horizon LX
7T MRI Siemens 10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist) Berlex 50419-188-02
2-0 silk suture Ethilon 685H
3-0 silk suture Ethilon 622H
3-0 monofilament suture Ethilon 627H

参考文献

  1. Qiao, H., et al. Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium. Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).
  2. Ye, L., et al. Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells. Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).
  3. Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).
  4. Yang, L., et al. Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols. PLoS One. 11 (1), e0147155 (2016).
  5. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).
  6. Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).
  7. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  8. Huber, I., et al. Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation. FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).
  9. Kita-Matsuo, H., et al. Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes. PLoS One. 4 (4), e5046 (2009).
  10. Choi, K. D., et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).
  11. Woll, P. S., et al. Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells. Blood. 111 (1), 122-131 (2008).
  12. Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).
  13. Rufaihah, A. J., et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).
  14. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  15. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).
  16. Tang, X. L., et al. Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction. Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).
  17. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  18. Davis, M. E., et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).
  19. Li, Q., et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).
  20. Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I. Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).
  21. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).

Play Video

記事を引用
Zhu, W., Gao, L., Zhang, J. Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (120), e55142, doi:10.3791/55142 (2017).

View Video