ライブイメージングのための成熟した筋線維のin vitro分化に

注：約2 35mm皿または2ライブイメージングの料理なので、計画mattings、解剖、それに応じてコーティングする（ステップ2.6）のための1匹のマウスの利回り十分な筋芽細胞。 10匹の動物 – 筋芽細胞は、シーケンシャル遠心分離し、プレめっきを介して分離されているので、プロトコルは5のバッチで行われるべきです。 動物を対象とするすべての手順は、研究所デMedicina分子と大学ピエールエマリー・キュリーで動物倫理委員会によって承認されました新生児マウス後肢の筋肉の1解剖事前（ 材料表 ）内のすべてのソリューションを準備し、濾過（0.22μmのフィルター）により滅菌します。すべてのメディアが基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）を含有する製剤を除き、細胞に添加する前に37℃であることを確認してください。 、湾曲はさみ、ストレートはさみ、定期的な鉗子：解剖材料（1のそれぞれを滅菌しますそして、先の細いピンセット）、70％エタノールでそれらを拭き作業台。 筋肉のコレクションのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）5mlで100ミリメートルペトリ皿を準備し、ミンチ工程まで氷上で保管してください。 ストレートはさみでP8マウスおよび70％エタノールで皮膚を殺菌 – P6を刎ねます。 背中の皮膚の切開部を作成し、それが除去されるまで後肢に向かってゆっくりと引いて、完全に後肢の筋肉組織を露出させます。 筋肉を損傷することなく、脂肪組織を除去するために鉗子を使用してください。 背側後肢の筋肉を削除するには、伸ばし手足を維持し、かかとの腱を露出するように足を曲げます。静かにスライドさせて上向きに切断することにより、腱から出発し、骨から筋肉を分離するために湾曲したハサミを使用してください。筋肉を切除し、氷冷DPBSに配置します。 先の細いピンセットで筋肉をつまんおよび大腿骨または膝関節に損傷を与えることなく、その周りを切断することにより、大腿四頭筋を分離します。すべての動物を解剖した後、以下のすべてのステップが実行されるべき無菌層流細胞培養フード、に進みます。 2.筋芽細胞の単離 DPBSの過剰を削除します。均一な塊を得るために、滅菌湾曲鋏で組織をミンチ。 消化ミックスの5ミリリットルを使用して50 mLコニカル遠心管中で細分化した組織を収集し、37℃で90分間攪拌しながら、それをインキュベートします。 解剖媒体の6ミリリットルを追加することによって、消化を停止し、残りの組織をペレットに75×gで5分間のサスペンションを遠心します。 注意深く上清を収集します。 組織破片を収集していないようにしてください 。 5分間350×gで、それを遠心。解剖培地5mLにそれを再懸濁します。 40μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。 <解剖培地25mlを加え、細胞培養インキュベーター中で4時間、150 mmディッシュでそれをpreplate（37℃、5％CO 2/サブ>）の線維芽細胞が付着することを可能にします。 室温で1時間の冷IMDMで100：プレプレーティングが、基底膜マトリックスの500μLとコートの料理は1に希釈しました。 DPBSで1回洗浄し、直ちに（ステップ2.8）に細胞をプレーやメッキまで増殖培地で残します。 プレプレーティングした後、上清を回収し、10分間、350×gでそれを遠心。 増殖培地中でそれを再懸濁し、血球計数器で細胞を数えます。 150,000および250,000細胞が基底膜マトリックスでコーティングしたシャーレごとにメッキされるように、音量を調整します。細胞培養インキュベーター中で細胞を保管してください。 3.筋線維の分化注：3日後、細胞を、約70％の密集度（ 図1B）で筋管を融合し、形成するために開始する必要があります。 所望であれば、この時点では、関心対象のsiRNAまたはDNAで細胞をトランスフェクトします。細胞は、トランスフェクトされるべきではない場合は、分化培地とスキーに直接変更pが3.4に進みます。 製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトします。 siRNAの脂質複合体（20 nMの+試薬の1μL）またはDNA-脂質複合体（1μgの+試薬の1μL）で5時間細胞をインキュベートします。必要に応じて、siRNAおよびDNA濃度を最適化します。 分化培地で1回洗った後、新しい分化培地に切り替えます。 次の日、基底膜マトリックス1を希釈：2を氷冷分化培地中。既存の培地を除去し、各皿に氷のように冷たい行列の200μLを追加します。 細胞培養インキュベーター中で30分間インキュベートします。 アグリン（100ng / mlの）と分化培地を補完し、慎重に細胞に2 mLを加え。 慎重に、常に100 ngの/μLの最終濃度にアグリンで補う、培地の半分ごとに2日を変更します。 細胞分化および生存率を監視します。このようなFBSおよびcなどの要因（の種類によって完全な成熟（ 図2）に到達するために10分化さd – hickenは胚芽抽出物起源）、細胞が5間がかかる場合があります。 ガラスボトムディッシュ4.免疫染色免疫染色のために、目的の任意の時点で、DPBSで細胞を1回洗浄し、10分間室温で4％PFAで固定し。 DPBSで二回、それらを洗ってください。この時点で、細胞を4℃で保存することができます。 RTで5分間、0.5％トリトンX-100でそれらを透過。 PBSで2回洗って、室温で30分間ブロッキング溶液でブロックします。 ソリューションのO / N、4°Cでブロッキング希釈した一次抗体を用いて、それらをインキュベートします。 室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。 二次抗体と室温で1時間のためのDAPI0.2μgの/ mLでそれらをインキュベートします。 室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。 マウンティング培地200μLを追加し、イメージングに進みます。