La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

NOTA: Un rendimenti del mouse mioblasti sufficiente per circa due piatti 35 mm o due piatti live-imaging, così stuoie piano, dissezione, e rivestimento (passo 2,6) di conseguenza. Dal momento che i mioblasti vengono isolati tramite centrifugazioni sequenziali e preplating, il protocollo dovrebbe essere fatto in lotti di 5 – 10 animali. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato etico degli animali a Instituto de Medicina Molecolare e Università Pierre et Marie Curie 1. La dissezione dei neonatale Mice muscoli posteriori degli arti Preparare tutte le soluzioni in anticipo (Materials Table) e sterilizzare per filtrazione (0,22 micron filtro). Assicurarsi che tutti i mezzi sono a 37 ° C prima dell'aggiunta alle celle, tranne le formulazioni contenenti matrice membrana basale (ad esempio, Matrigel). Sterilizzare il materiale dissezione (uno ciascuno di: forbici curve, forbici, pinze diritte regolari,e pinze fine-tip) e il banco di lavoro pulendo con il 70% di etanolo. Preparare da 100 mm capsula di Petri con 5 ml di Dulbecco tampone fosfato (DPBS) per la raccolta dei muscoli e tenerlo in ghiaccio fino al passo macinazione. Decapitare P6 – P8 topi con le forbici diritte e sterilizzare la pelle con il 70% di etanolo. Fare un'incisione nella pelle indietro e tirare delicatamente verso gli arti posteriori fino a quando non viene rimosso, esponendo completamente la muscolatura degli arti posteriori. Utilizzare le pinze per rimuovere il tessuto grasso senza danneggiare i muscoli. Per rimuovere le dorsali muscoli posteriori degli arti, tenere l'arto allungato e piegare la zampa per esporre i tendini del tallone. Utilizzare le forbici curve al muscolo separata dall'osso, partendo dai tendini, facendo scorrere verso l'alto e tagliando delicatamente. Accise L'muscoli e metterli in DPBS ghiacciate. Isolare il quadricipite pizzicando il muscolo con una pinza fine-tip e il taglio intorno ad esso senza danneggiare il femore o del ginocchio. Dopo la dissezione tutti gli animali, procedere ad una cappa di coltura cellulare a flusso laminare sterile, dove devono essere eseguiti i seguenti passaggi. Isolamento 2. Myoblast Rimuovere l'eccesso di DPBS. Macinare il tessuto con forbici curve sterilizzati in modo da ottenere una massa uniforme. Raccogliere il tessuto macinate in una provetta da centrifuga da 50 ml conica con 5 ml di miscela di digestione e incubare con agitazione a 37 ° C per 90 min. Arrestare la digestione aggiungendo 6 mL di media dissezione e centrifugare la sospensione per 5 min a 75 xg per sedimentare il tessuto rimanente. Raccogliere accuratamente il surnatante. Assicurarsi di non raccogliere i detriti dei tessuti. Centrifugare a 350 xg per 5 min; risospendere in 5 mL di media dissezione. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cella 40 micron. Aggiungere 25 ml di mezzo dissezione e preplate in un piatto di 150 mm per 4 h in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C e 5% CO 2 </ Sub>) per consentire ai fibroblasti di aderire. Mentre preplating, piatti cappotto con 500 ml di matrice membrana basale diluito 1: 100 in IMDM fredda per 1 ora a RT. Lavare una volta con DPBS e piastra immediatamente le cellule (passo 2.8) o lasciare con terreno di coltura fino placcatura. Dopo preplating, raccogliere il surnatante e centrifugare a 350 xg per 10 min. Risospendere in mezzo di crescita e contare le cellule su un emocitometro. Regolare il volume in modo che tra 150.000 e 250.000 cellule sono placcati per membrana basale piatto matrice rivestite. Mantenere le cellule in un incubatore di coltura cellulare. 3. Differenziazione myofiber NOTA: Dopo 3 d, le cellule devono iniziare a fondere e formare miotubi intorno al 70% di confluenza (Figura 1B). A questo punto, trasfezione delle cellule, se desiderato, con un siRNA o DNA di interesse. Se le cellule non devono essere transfettate, modificare direttamente al terreno di differenziamento e scip al passo 3.4. Trasfezione con i reagenti di trasfezione seguito le istruzioni del produttore. Incubare le cellule per 5 h con complessi siRNA-lipidi (20 Nm + 1 ml di reattivo) o complessi DNA-lipidi (1 mg + 1 ml di reagente). Ottimizzare le concentrazioni di siRNA e di DNA, se necessario. Lavare una volta con mezzo di differenziazione e quindi passare al nuovo mezzo di differenziazione. Il giorno seguente, diluire la matrice membrana basale 1: 2 in terreno di differenziamento ghiacciata. Rimuovere il supporto esistente e aggiungere 200 ml di matrice ghiacciata per ogni piatto. Incubare per 30 minuti in un incubatore di coltura cellulare. Supplemento del mezzo di differenziazione con agrina (100 ng / mL) e aggiungere con cautela 2 ml per le cellule. Cambiare con cura la metà del mezzo ogni 2 d, sempre che completa con agrina ad una concentrazione finale di 100 ng / ml. Monitorare la differenziazione cellulare e la vitalità. A seconda di una varietà di fattori (come FBS ecHicken embrione origini estratto), le cellule potrebbe richiedere tra i 5 – 10 differenziazione d per raggiungere la piena maturazione (Figura 2). 4. Immunocolorazione in piatti con fondo di vetro Per immunostaining, in qualsiasi momento, di interesse, lavare le cellule una volta con DPBS e fissarle con 4% PFA a temperatura ambiente per 10 min. Lavare due volte con DPBS. A questo punto, le cellule possono essere conservati a 4 ° C. li permeabilize con 0,5% Triton X-100 per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte con PBS e bloccare con soluzione bloccante per 30 minuti a RT. incubare con l'anticorpo primario diluito in soluzione bloccante O / N a 4 ° C. Lavare 3x con DPBS per 5 minuti a temperatura ambiente. li Incubare con l'anticorpo secondario e 0,2 mg / ml di DAPI per 1 ora a RT. Lavare 3x con DPBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 200 ml di mezzo di montaggio e procedere a delle immagini.