在成熟的肌纤维诱导分化实时成像

注意：一个鼠标的产量足够的成肌细胞大约两张35毫米的菜肴或两个活成像菜，所以计划mattings，夹层，和涂层（步骤2.6）相应。 10只动物 – 由于肌细胞是通过连续的离心和预镀隔离，协议应在5个批次进行。 所有涉及动物对象的程序是由动物伦理委员会研究所德MEDICINA分子与大学皮埃尔与玛丽·居里批准 1.新生小鼠后肢肌肉解剖提前（ 材料表 ）准备所有的解决方案，并通过过滤（0.22微米过滤器）消毒。确保所有媒体都在37℃下除细胞之前，除了含有基底膜基质（ 例如，基质胶）的制剂。 消毒夹层材料（每个之一：剪子弯，直剪刀，镊子定期，和细尖镊子），并通过用70％乙醇擦拭的工作台上。 制备100毫米培养皿用5ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的肌肉收集和保持在冰上，直到切碎步骤。 斩首P6 – P8小鼠直剪刀和消毒用70％乙醇的皮肤。 使背部皮肤切口，然后轻轻向外拉出后肢，直到它被删除，完全暴露后肢肌肉组织。 使用钳去除脂肪组织而不损伤肌肉。 要卸下背后肢肌肉，保持伸展肢体和弯曲的爪子，露出脚后跟肌腱。骨用剪子弯分离肌肉，从肌腱出发，通过轻轻滑动和切割以上。切除的肌肉，并放置在冰DPBS。 由俭用细尖镊子肌肉和周围切割而不会损坏或股骨的膝关节隔离股四头肌。解剖所有动物后，继续到无菌层流细胞培养罩，确定应执行以下所有步骤。 2，成肌细胞分离除去多余的DPBS的。讳言灭菌弯曲剪刀组织，以获得一个均匀的质量。 收集在用5毫升消化混合物的50毫升锥形离心管中的组织糜和在37℃搅拌孵育它为90分钟。 通过在75 XG加入6毫升夹层介质和离心5分钟的悬浮液，以沉淀剩余的组织停止消化。 仔细收集上清。 确保不收集组织碎片 。在350×g离心5分钟离心它;它悬浮在5毫升夹层介质中。 通过40微米的细胞滤网过滤细胞悬浮液。添加25夹层介质中的溶液，并preplate它在150毫米的菜用于在细胞培养孵育箱（4小时37℃，5％CO 2的</子>），以允许成纤维细胞附着。 在冷的IMDM 100在RT 1小时：在预镀，外套菜肴基底膜基质的500微升稀释1。用DPBS洗一次，并立即板上的细胞（步骤2.8）或生长培养基，直到电镀离开。 预镀后，收集上清液并在350 xg离心离心它为10分钟。 重悬在它生长介质和细胞计数的血球。调节音量，使细胞150,000 250,000是每个基底膜基质涂，镀菜。保持所述细胞在细胞培养孵化器。 3.肌纤维分化注：3天后，将细胞应在约70％汇合（ 图1B）开始保险丝和形式肌管。 在这点上，转染的细胞，如果需要的话，用siRNA或感兴趣的DNA。如果细胞不被转染，直接切换到分化培养基和滑雪p依次3.4。 用按照制造商的说明书转染试剂转染。孵育用siRNA脂质复合物5小时的细胞（为20nM + 1微升试剂）或DNA-脂质复合物（1微克试剂+1μL）。如有必要，优化siRNA和DNA的浓度。 与分化培养基清洗过一次，然后切换到新的分化培养基。 在冰冷的分化培养基2：第二天，稀释基底膜基质1。删除现有的媒体，并添加冰冷的基质200微升到每道菜。 孵育在细胞培养孵化30分钟。 补充与集聚蛋白的分化培养基（100毫微克/毫升），并小心加入2毫升到细胞中。 仔细改一半培养基的每2天，总是与集聚蛋白补充至100毫微克/微升的最终浓度。 监测细胞分化和生存力。取决于多种因素（如胎牛血清和chicken胚胎提取物的起源），细胞可能需要5之间- 10分化d可达到完全成熟（ 图2）。 4.免疫染色玻璃底菜对于免疫染色，在感兴趣的任何时间点，用DPBS洗涤细胞一次，并解决这些问题用4％PFA在RT 10分钟。 用DPBS洗两次。在这一点上，可以将细胞储存于4℃。 用0.5％的Triton X-100通透它们在RT 5分钟。 用PBS洗两次，并用在室温阻断30分钟溶液阻塞。 用在阻断溶液O / N在4℃下稀释的初级抗体孵育它们。 洗3次用DPBS在RT 5分钟。 与二级抗体和DAPI的0.2微克/毫升1小时在室温下孵育它们。 洗3次用DPBS在RT 5分钟。 添加安装介质的200μL并继续成像。