概要

הגנום כולו בתיווך ניתוח של HDAC מעכב אפנון של מיקרו Rna ו mRNAs ב B תאים המושרה Undergo מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה, התמיינות תאים פלזמה

Published: September 20, 2017
doi:

概要

גורמים epigenetic יכול לקיים אינטראקציה עם תוכניות גנטית כדי לווסת את ביטוי גנים ולווסת תא B פונקציה. על ידי שילוב חוץ גופית ב B-cell גירוי, לרביעיית-PCR, ו- microRNA בתפוקה גבוהה-רצף וגישות mRNA-רצף, אנחנו ניתן לנתח את אפנון epigenetic הביטוי miRNA וג’ין בתאי B.

Abstract

תגובות נוגדנים מוכשרות דרך מספר תהליכי תא B קריטי-מהותי, לרבות היפרמוטציה (SHM), מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) התמיינות תאים פלזמה. בשנים האחרונות שינויים epigenetic או גורמים, כגון היסטון deacetylation מיקרו Rna (miRNAs), הוכחו אינטראקציה עם תוכניות גנטי B-cell לעיצוב תגובות נוגדנים, בעוד כבר מצאו את תפקוד של גורמים epigenetic להוביל נוגדן עצמי תגובות. ניתוח miRNA הגנום כולו והביטוי mRNA בתאים B בתגובה מאפננים epigenetic חשוב להבנת epigenetic ויסות התגובה נוגדן והפונקציה B-cell. . הנה, נדגים פרוטוקול גרימת B תאים לעבור התמיינות CSR ותא פלזמה, מתייחס האלו תאי B עם מעכבי היסטון deacetylase (HDAC) (HDIs), וניתוח mRNA microRNA הבעה. ב פרוטוקול זה, ננתח ישירות רצפי DNA (cDNA) משלימים באמצעות הדור הבא רצפי mRNA (mRNA-seq) וטכנולוגיות miRNA seq, מיפוי של הרצף מקריאה הגנום, ואת שעתוק במהופך כמותית (לרביעיית)-PCR. עם הגישות הללו הגדרנו, בתאי B המושרה לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות, HDI, הרגולטור epigenetic, באופן סלקטיבי ממיקרו miRNA והביטוי mRNA ומשנה בידול CSR ותא פלזמה.

Introduction

סימני epigenetic או גורמים, כגון מתילציה DNA, שינויים posttranslational היסטון אי קידוד RNAs (כולל מיקרו Rna), לווסת את תפקוד התא על ידי שינוי בביטוי גנים1. שינויים epigenetic לווסת את פונקציית B לימפוציטים, כגון אימונוגלובולינים מחלקה-מתג ה-DNA רקומבינציה (CSR) היפרמוטציה (SHM), התמיינות תאי זיכרון B או תאים פלזמה, ובכך להתכוונן נוגדן של נוגדן עצמי תגובות2,3. CSR SHM אנושות דורשים הפעלה-induced cytidine deaminase (סיוע, המקודדים כ- Aicda), אשר הוא מאוד המושרה בתאי B בתגובה תלויי-T ו- T-עצמאית אנטיגנים4. בתאי B class-החלפת/hypermutated נוספות להבדיל לתאי פלזמה, אשר מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים אופנה אנושות תלויה ההבשלה לימפוציטים B-induced חלבון (Blimp1, בקידוד Prdm1) 15. שינויים epigenetic נורמלי בתאי B עלול לגרום תגובות נוגדנים סוטה/נוגדן עצמי, אשר יכול להוביל תגובה אלרגית או מחלת חיסון עצמי1,4. הבנת epigenetic כמה גורמים, כגון miRNAs, לווסת תא B-מהותי ביטוי גנים הוא לא רק חשוב להתפתחות חיסון, אך היא חיונית כדי לחשוף את המנגנון של תגובות נוגדנים חריג/נוגדן עצמי פוטנציאליים.

היסטון acetylation deacetylation שינויים של משקעי ליזין על חלבוני היסטון מזורז בדרך כלל על ידי היסטון acetyltransferase (כובע) היסטון deacetylase (HDAC) בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. לבצע שינויים אלה להוביל הנגישות עולה או יורדת של כרומטין, עוד יותר לאפשר או למנוע את הכריכה של גורמי שעתוק או חלבונים ל- DNA ואת משינוי של ג’ין ביטוי5,6, 7 , 8. מעכבי HDAC (HDI) הם קבוצה של תרכובות להפריע הפונקציה של HDACs. כאן השתמשנו HDI (VPA) לכתובת ברגולציה של HDAC על הפרופיל ביטוי גנים פנימיים של תאים B ועל מנגנון שלה.

miRNAs הם קטנים, ללא קידוד RNAs כ 18 עד 22 נוקלאוטידים אורך הנוצרות דרך מספר שלבים. miRNA מארח את הגנים הם עיבד ויוצרים מיקרו Rna ראשוני סיכת ראש (pri-miRNAs). והם מיוצאים אל הציטופלסמה, איפה pri-miRNAs הם עיבוד נוסף לתוך קודמן miRNAs (pre-miRNAs). לבסוף, בוגרת miRNAs נוצרות דרך החריץ של טרום-miRNAs. miRNAs לזהות את רצפי משלימה באזור 3′ לא מתורגם של6,mRNAs7שלהם היעד. דרך להשתיק post-transcriptional, miRNAs לווסת את פעילות הסלולר, כגון התפשטות, התמיינות אפופטוזיס10,11. כיוון miRNAs מרובים ניתן לייעד את ה-mRNA זהה, miRNA יחיד אחד ניתן לייעד באופן פוטנציאלי mRNAs מרובים, חשוב לקבל תצוגה לפי הקשר של פרופיל ביטוי miRNA כדי להבין את הערך של הפרט ואת השפעת miRNAs קולקטיבית. miRNAs הוכחו להיות מעורב B-cell פיתוח, בידול היקפיים, כמו גם בידול ספציפיות שלב B-cell נוגדנים בתגובה, מחלת חיסון עצמי1,4,9. 3′ UTR של Aicda , Prdm1, ישנם מספר מאומתים או החזוי אבולוציונית שנשמרת אתרי ניתן לפלח מאת miRNAs8.

אפנון epigenetic, לרבות שינוי היסטון שעתוק שלאחר miRNAs, להציג דפוס ספציפיות שלב התקנה מסוג תא ותא של ביטוי גנים9. כאן, אנו מתארים שיטות כדי להגדיר את אפנון בתיווך HDI של miRNA ואת הביטוי mRNA, CSR, ו פלזמה תאית התמיינות. אלה כוללים את הפרוטוקולים עבור גרימת B תאים לעבור CSR ו פלזמה תאית התמיינות; לטיפול תאי B עם HDI; עבור ניתוח miRNA והביטוי mRNA מאת לרביעיית-PCR miRNA-seq, mRNA-seq10,11,12,8,13.

Protocol

הפרוטוקול מנחים את טיפול בבעלי חיים מוסדיים בעלי חיים והטיפול שימוש ועדות של האוניברסיטה של טקסס למדעי הבריאות במרכז סן אנטוניו. 1. גירוי של העכבר בתאי B CSR, פלזמה תאית התמיינות של טיפול HDI הכנה של הטחול תא המתלים הערה: לבצע את כל השלבים ב תא למינארי מלבד העכ?…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול שלנו לטהר בתאי B להניח LPS (3 µg/mL) ו- IL-4 (5 ng/mL) עבור 96 h יכול לגרום 30-40% CSR כדי IgG1 ו ~ 10% של התמיינות תאים פלזמה. לאחר טיפול עם HDI (500µM VPA), נציג שירות הלקוחות כדי IgG1 ירד ל 10-20%, בעוד התמיינות תאים פלזמה ירד ל ~ 2% (איור 1). בתיווך HDI עיכוב של CSR אושר עוד יותר ע י מספר…

Discussion

פרוטוקול זה מספק גישות מקיף לזירוז תא B class מיתוג ובידול תאים פלזמה; כדי לנתח את השפעתם על ידי epigenetic מאפננים, כלומר HDI; כדי לזהות את ההשפעה של HDI על mRNA והביטוי miRNA בתאים אלה. רוב הגישות הללו יכולים לשמש גם כדי לנתח את השפעת גורם epigenetic על הביטוי mRNA/miRNA והפונקציה B-cell האנושי. לרביעיית-PCR וגישות mRNA-seq/…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH AI 105813 ו- AI 079705 (למחשב), הברית לזיהוי לופוס מחקר היעד בלופוס גרנט ALR 295955 (למחשב), המחקר דלקת מפרקים קרן מחקר לאומי להעניק (HZ). TS נתמכה על ידי ברפואת ילדים במרכז הרפואי, החולים Xiangya השנייה, אוניברסיטת דרום סנטרל, צ’אנגשה, סין, בהקשר של התוכנית הביקור של סטודנט לרפואה Xiangya-UT הספר של רפואה סן אנטוניו.

Materials

C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific – Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

参考文献

  1. Allis, C. D., Jenuwein, T. The molecular hallmarks of epigenetic control. Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).
  2. Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. Epigenetics of the antibody response. Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).
  3. Zan, H., Casali, P. Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response. Front Immunol. 6, 631 (2015).
  4. Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond. Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).
  5. Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).
  6. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  7. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
  8. White, C. A., et al. Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses. J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).
  9. Farh, K. K., et al. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants. Nature. 518, 337-343 (2015).
  10. Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis. Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).
  11. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).
  12. Luo, S. MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform. Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).
  13. Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation. Front. Immunol. 6, 627 (2015).
  14. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).
  15. Kin, T., et al. fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences. Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 4, (2015).
  17. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).
  18. Anders, G., et al. doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation. Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).

Play Video

記事を引用
Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

View Video