概要

HDAC 抑制剂介导的 B 细胞 rna 和基因的基因组分析--诱导进行类开关 DNA 重组和血浆细胞分化

Published: September 20, 2017
doi:

概要

后生因素可以与基因程序相互作用, 调节基因表达, 调节 B 细胞功能。结合体外b 细胞刺激、qRT PCR、高通量 rna 序列和 mRNA 序列方法, 可以分析 b 细胞中 miRNA 和基因表达的表观遗传调控。

Abstract

抗体应答是通过几个关键的 B 细胞内在的过程来完成的, 包括体细胞变异 (SHM), 类开关 DNA 重组 (CSR) 和血浆细胞分化。近年来, 表观遗传修饰或因素, 如组蛋白脱乙酰和 rna (rna), 已被证明与 B 细胞的遗传程序, 以形成抗体反应, 而表观遗传因素的功能障碍已发现导致自身抗体应答。分析 b 细胞的基因组全 miRNA 和 mRNA 表达对表观遗传调节因子的反应, 对于了解 b 细胞功能和抗体应答的表观遗传调节具有重要意义。在这里, 我们演示了一个协议诱导 b 细胞进行 CSR 和细胞分化, 治疗这些 b 细胞与组蛋白乙酰 (HDAC) 抑制剂 (助), 并分析 mRNA 和 rna 表达。在这个协议, 我们直接分析互补 DNA (cDNA) 序列使用下一代 mrna 测序 (mrna-seq) 和 miRNA 的技术, 测序读取的基因组, 和定量的反向转录 (qRT)-PCR。通过这些方法, 我们已经定义, 在 B 细胞中诱导的 csr 和细胞分化, 人类发展指数, 一个后生的调节器, 选择性地调节 miRNA 和 mRNA 表达, 改变 csr 和细胞分化。

Introduction

表观遗传标记或因素, 如 DNA 甲基化, 组蛋白后修饰, 编码 rna (包括 rna), 通过改变基因表达1调节细胞功能。表观遗传修饰调节 b 淋巴细胞功能, 如免疫球蛋白类-开关 DNA 重组 (CSR), 体细胞变异 (SHM), 并分化为记忆 b 细胞或血浆细胞, 从而调节抗体和自我抗体响应2,3。CSR 和 SHM 的关键要求激活诱导的胞脱氨酶 (援助, 编码为Aicda), 这是高度诱导 B 细胞响应 t 依赖性和 t 独立抗原4。类交换/hypermutated b 细胞进一步分化成血浆细胞, 其中分泌大量的抗体在时尚严重依赖于 B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 1 (Blimp1, 编码为Prdm1)5。B 细胞异常的表观遗传变化可能导致异常的抗体/自身抗体应答, 这会导致过敏反应或自身免疫1,4。了解后生因素, 如 rna, 调节 B 细胞内在基因表达不仅对疫苗的发展很重要, 而且对于揭示潜在的异常抗体/自身免疫反应的机制也是必不可少的。

组蛋白乙酰化和脱乙酰度是由组蛋白乙酰 (HAT) 和组蛋白乙酰 (HDAC) 催化的蛋白组蛋白的赖氨酸残留修饰。这些修改导致染色质的增加或减少的可及性, 并进一步允许或阻止转录因子或蛋白质与 DNA 的结合和基因表达的改变5,6,7,8. HDAC 抑制剂 (HDI) 是一类干扰 HDACs 功能的化合物。在这里, 我们使用 HDI (VPA) 来解决 HDAC 对 B 细胞固有基因表达谱的调节及其机制。

rna 是小的, 编码 rna 大约18到22核苷酸长度是通过几个阶段产生的。miRNA 寄主基因转录和形成发夹主 rna (pri-rna)。它们被出口到细胞质中, 其中 rna 被进一步加工成前体 rna (pre-miRNAs)。最后, 成熟的 rna 是通过 pre-miRNAs 的裂解形成的。rna 识别在其目标基因的 3 “未翻译区域” 中的互补序列6,7。通过后沉默, rna 调节细胞活动, 如增殖, 分化, 和凋亡10,11。由于多个 rna 可以针对同一 mRNA, 而一个单一的 miRNA 可能针对多个基因, 因此重要的是要有一个上下文视图的 miRNA 表达式配置文件, 以了解个人的价值和 rna 的集体效应。rna 已被证明参与 b 细胞的发育和外周分化, 以及 b 细胞阶段特异性分化, 抗体应答, 和自身免疫1,4,9。在 3 “UTR AicdaPrdm1中, 有几个经过验证或预测的进化保守站点, 可通过 rna8进行攻击。

后生调制, 包括组蛋白后修饰和 rna, 显示一个细胞类型和细胞阶段特异的基因表达调控模式9。在这里, 我们描述的方法, 以确定人的 HDI 介导的 miRNA 和 mRNA 表达, 社会责任, 和血浆细胞分化。其中包括诱导 B 细胞接受 CSR 和细胞分化的协议;用 HDI 治疗 B 细胞;并通过 qRT PCR、miRNA-seq 和 mrna-seq101112813来分析 miRNA 和 mrna 的表达。

Protocol

该协议遵循圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物保育和使用委员会的动物保育准则. 1. 刺激企业社会责任、血浆细胞分化和 HDI 治疗的小鼠 B 细胞 脾细胞悬浮液的制备 注: 执行除鼠标外的层流罩中的所有步骤安乐死和解剖。 通过 CO 2 吸入安乐特定的无病原体 C57BL/6J 小鼠 (8-12 周龄)。 将鼠标放在解剖板上, 腹部朝上。…

Representative Results

使用我们的协议, 纯化 B 细胞放置 LPS (3 µg/毫升) 和 IL-4 (5 ng/毫升) 的96小时可以诱导30-40% 的 CSR 到 IgG1 和〜10% 的血浆细胞分化。在与 HDI (500µM VPA) 治疗后, 对 IgG1 的 CSR 降低到 10-20%, 而血浆细胞分化降低到 ~ 2% (图 1)。post-recombination Iμ-Cγ1和成熟的 VhDJh-Cγ1记录的数量的减少进一步证实了 HDI 对 csr 的抑制, 这是已完成的 csr 的标志。由 qRT-PCR 测量,…

Discussion

该协议提供了诱导 B 细胞类交换和细胞分化的综合方法;分析其对表观遗传调节剂的影响, 即 HDI;并检测人的 HDI 对这些细胞的 mRNA 和 miRNA 表达的影响。大多数这些方法也可以用来分析表观遗传因子对人 B 细胞功能和 mRNA/miRNA 表达的影响。qRT PCR 和 mRNA-seq/miRNA 的方法也可以用来分析 B 细胞分离的小鼠与后生调节剂, 如助。

表观遗传调节可能影响细胞增殖和活力等多种不同的细胞?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到 NIH 资助 ai 105813 和 ai 079705 (对 pc), 狼疮研究的目标识别联盟狼疮补助金 ALR 295955 (对 pc), 和关节炎国家研究基金会研究补助金 (HZ)。TS 由中国长沙中南大学第二湘医院儿科医学中心支持, 湘医学院圣安东尼奥医科学生访问计划的背景。

Materials

C57BL/6 mice Jackson Labs 664
Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) Fisher Scientific MT 10-040-CV 
FBS Hyclone SH300
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL Fisher Scientific – Hyclone SV3007901 
β-Mercaptoethanol Fisher Scientific 44-420-3250ML
Falcon Cell Strainers Fisher Scientific 21008-952  
Trypan Blue Stain 0.04% GIBCO/Life Technologies/Inv 15250
ACK Lysis Buffer  Fisher Scientific BW10-548E 
Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber Fisher Scientific 02-671-51B
EasySep Magnet Stem Cell Technologies 18000
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap Fisher Scientific 14-959-1A
EasySep Mouse B cell Isolation Kit Stem Cell Tech 19854
BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box  BD Biosciences  305199
PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody BioLegend  142513 (25 ug)
PE-Cy7 B220 antibody BioLegend 103222
7-AAD (1 mg) Sigma Aldrich A9400-1MG
APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody Biolegend 103212
Mouse APC-IgG1 200 µg Biolegend 406610
FITC anti-mouse IgM Antibody Biolegend 406506
FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody Biolegend 103206
PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) Biolegend 103208
HBSS 1X Fisher Scientific MT-21-022-CM
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated  Fisher Scientific BP1600-100
LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) Sigma Aldrich L2880-25MG
Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) BioLegend 574302 (size: 10 ug)
Valproic acid sodium salt Sigma Aldrich P4543
SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet The Baker Company SG404
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator  Thermo Scientific 3950
Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 Fisher Scientific 15-462-5Q
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube Fisher Scientific  14-959-5
Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes  Fisher Scientific  05-538-59A
1.7 mL Microtube, clear Genesee 22-282
Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml Fisher Scientific 06-443-18
ELMI SkySpin CM-6MT ELMI CM-6MT
Rotor 6M ELMI 6M
Rotor 6M.06 ELMI 6M.06
Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller Drummond Scientific 4-000-101
25 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-900
10 mL serological pipette tips Fisher Scientific 89130-898
5 mL serological pipette tips Fisher Scientific 898130-896
48-well plates Fisher Scientific 07-200-86
Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated Beckman Coulter 366802
GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance Beckman Coulter 366650
Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated Beckman Coulter 369434
TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle Beckman Coulter 368298
Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 Fisher Scientific 13-100-675
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer  Fisher Scientific 02-215-365
miRNeasy Mini Kit (50) Qiagen 217004
Direct-zol RNA MiniPrep kit Zymo Research R2050
Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) Fisher Scientific BP1145-1
Rnase-Free Dnase set (50) QIAGEN 79254
NanoDrop 2000 Spectrophotometers Thermo Scientific ND-2000
Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR Invitrogen 175013897
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-rad  172-5121
Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 Fisher 14-230-244
Microseal 'B' Adhesive Seals Bio-Rad MSB-1001
MyiQ Optics Module Bio-Rad 170-9744
iCycler Chassis Bio-Rad 170-8701
Optical Kit Bio-Rad 170-9752
BD LSR II Flow Cytometry Analyzer BD Biosciences
FACSDiva software BD Biosciences
FlowJo 10 BD Biosciences
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2943CA
S200 Focused-ultrasonicator Covaris S200
SPRIworks Fragment Library System I for Illumina Beckman Coulter A288267
cBot Cluster Generation Station illumina SY-312-2001
HiSeq 2000 Genome Sequencer Illumina SY-401-1001
TruSeq RNA Library Prep Kit v2 Illumina RS-122-2001
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012
NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 Bioo Scientific 5132-05
2200 TapeStation Agilent G2964AA

参考文献

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記事を引用
Sanchez, H. N., Shen, T., Garcia, D., Lai, Z., Casali, P., Zan, H. Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (127), e55135, doi:10.3791/55135 (2017).

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