Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.
New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.
Clostridium несговорчивый является одной из основных причин внутрибольничных антибиотик-ассоциированной диареи инфекций 1. Этот грамположительных анаэробной бактерии передается через споровой форме через фекально-оральным путем. В последнее десятилетие, новая '' эпидемия '' или '' гипервирулентных '' штаммов (например , BI / NAP1 / 027) вызвало резкое увеличение числа новых инфекций и летальности в Северной Америке и Европе 2. C. несговорчивый -associated болезнь (РЕТЕНЦИИ) является опасным для жизни воспаление толстой кишки с высоким уровнем смертности 3. Симптомы варьируются от диареи 4 до псевдомембранозного колита 5 и часто со смертельным исходом токсического мегаколон 6.
Лечение РЕТЕНЦИИ трудно , как вирулентные штаммы с множественной лекарственной устойчивостью и частота рецидивов высока 7. В данный момент терапия включает в себя антибиотики метронидазол, fidaxomicin или ванкомицин, или в repetitiVely рецидивирующие случаи фекальные трансплантации микрофлора. Новые терапевтические стратегии срочно необходимы 8. Определенный прогресс записывается в качестве терапевтического моноклональных антител Bezlotoxumab, нацеливание C. несговорчивый токсин B 9, недавно успешно прошел III фазы клинических испытаний и был подан на утверждение с FDA и EMA. Кроме того, новые антибиотики испытываются в данный момент на разных стадиях клинических испытаний 10.
Для разработки эффективного лечения новые терапевтические мишени должны быть идентифицированы. Недавно обнаруженный C. несговорчивый протеазы пролин-пролина эндопептидазы-1 (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) является таким перспективной мишенью, как отсутствие PPEP-1 в нокаут-штамм уменьшает вирулентность C . несговорчивый в естественных условиях 11. PPEP-1 представляет собой секретируемый металлопротеазы 12,13 расщепляющие два C.difficile , адгезинов на их С-конца 13 , таким образом , освобождая клейкий BacterИ. из человеческого кишечника эпителия. Таким образом, она участвует в поддержании баланса между сидячим и мотильных фенотипа C. несговорчивый. Для разработки селективных ингибиторов против PPEP-1 и понять, как он признает свои субстраты глубокое знание его трехмерной структуры является необходимым условием. Мы решили первую кристаллическую структуру PPEP-1 по отдельности и в комплексе с субстратом пептида 14. PPEP-1 является первой известной протеазы , которые селективно расщепляет пептидные связи между двумя остатками пролина 15. Он связывает субстрат в двойном перекручены образом и стабилизирует его через расширенную жирноароматических сеть остатков , расположенных в S-петле , которая покрывает протеазы активного сайта 14. Этот режим субстратсвязывающих является уникальным для PPEP-1 и не нашли в человеческих протеаз на сегодняшний день. Это делает его перспективным объектом наркотиков, и вне мишени эффекты ингибиторов очень маловероятно.
Для разработки и экрана селективного PPEP-1 вдыханиеibitors в будущем требуется большое количество чистой и монодисперсному PPEP-1 белка. Кроме того, для определения режима связывания первых ингибиторов, со-кристаллических структур с PPEP-1 должны быть определены. В наших руках PPEP-1 постоянно производит сросшиеся кристаллы. Таким образом, мы разработали процедуру оптимизации для получения монокристаллов дифракционного качества PPEP-1. В этом протоколе мы опишем подробно производства, очистки, кристаллизации и структуру раствора PPEP-1 14. Мы используем внутриклеточную экспрессию в кишечной палочки из более PPEP-1 варианта , лишенного сигнальной последовательности секреции, аффинной хроматографии и гель -проникающей хроматографии с удалением метки очистки, а затем microseeding 16 в экране оптимизации и определения структуры с помощью цинка монохромному аномальной дисперсии (цинк-SAD) 17. Этот протокол может быть адаптирован для определения производства и структуры других белков (например , </ EM> металлопротеаз) и, в частности, для белков, производящих сросшиеся кристаллы. По запросу ДНК плазмиды конструкции (pET28a-Nhis-rPPEP-1) и дифракционные данные могут быть предоставлены для образовательных целей.
Рентгеновская кристаллография по- прежнему является самым быстрым и точным методом для определения трехмерных вблизи атомных структур разрешением белков 28. Тем не менее, это требует роста хорошо упорядоченных монокристаллов. Они часто трудно получить и кристаллическое состоян…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим сотрудников на пучкового X06DA в швейцарском Источник света, Поль-Шерера-института, Villigen, Швейцария для поддержки во время сбора синхротронное данных. Мы благодарны Monika Гомперт за отличную техническую поддержку. Проект был поддержан Кельнского университета и предоставить INST 216 / 682-1 FUGG из Научно-исследовательского совета Германии. Она является доктором наук стипендия от Международной высшей школы в области здравоохранения и развития болезни к CP признается. Исследований, приведших к этим результатам получил финансирование из Седьмой рамочной программы Европейского Сообщества (FP7 / 2007-2013) по гранту договору № 283570 (BioStruct-X).
Genes / Vectors / cell strains | |||
pET28a vector | Merck-Millipore | 69864 | Thrombin cleavable N-terminal His-tag |
E. coli strain BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | RNase H deficient |
Codon-optimized gene (for E. coli) of PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | custom | amino acids 27-220 |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Chemicals | |||
Yeast extract | any | ||
Tryptone | any | ||
Antifoam B | Sigma-Aldrich | A5757 | aqueous-silicone emulsion |
Agar | any | ||
Kanamycin | any | ||
IPTG | AppliChem | A1008 | |
Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Buffer grade |
NaCl | any | Buffer grade | |
DNaseI | AppliChem | A3778 | |
Imidazole | AppliChem | A1073 | Buffer grade |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T4648 | |
Ammonium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 215996 | |
Glycerol 100% | any | purest grade | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Liquid nitrogen | any | for storage and cryocooling of crystals | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment (general) | |||
Shaking incubator | any | providing temperatures of 20 °C – 37 °C | |
Glassware | any | baffled Erlenmeyer flasks (50 ml – 2.8L) | |
Centrifuge for large culture volumes | any | centrifuge for processing volumes up to 12 L | |
Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | or any other sonicator / cell disruptor |
Ultracentrifuge | any | centrifuge providing speeds up to 150.000 x g | |
NiNTA Superflow resin | Qiagen | ||
Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 | or any other empty glass or plastic column |
Size exclusion chromatography column HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
Chromatography system Äkta Purifier | GE Healthcare | 28406264 | or any other chromatography system |
Dialysis tubing Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
Dialysis tubing closures | Spectrum Labs | 132738 | |
Ultrafiltration units (concentrators) 10.000 NWCO | any | ||
UV-Vis spectrophotometer | any | ||
Name | Company | Catalog Number | コメント |
Equipment (crystallography) | |||
Low volume pipette 0.1-10 µl | any | ||
Positive displacement pipette Microman M10 | Gilson | F148501 | |
Crystallization robot | any | ||
96-well crystallization plates TTP IQ with three protein wells | TTP | 4150-05810 | or any other 96-well crystallization plate |
24-well CombiClover Junior Plate | Jena Bioscience | EB-CJR | |
Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR3-511 | |
Siliconized Glass Cover Slides | Hampton Research | HR3-225 | |
Commercial crystallization screens: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diverse | |
Commercial crystallization screens: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverse | |
JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
CrystalCap SPINE HT (nylon loops) | Hampton Research | diverse | loop sizes 0.025 mm – 0.5 mm |
CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
Cryogenic Foam Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
Cryogenic Foam Dewar 2L | Hampton Research | HR4-675 | |
Vial Clamp, Straight | Hampton Research | HR4-670 | |
CrystalWand Magnetic, Straight | Hampton Research | HR4-729 | |
CryoCane 6 Vial Holder | Hampton Research | HR4-711 | |
CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
CryoCane Color Coder – White | Hampton Research | HR4-713 | |
Scalpel | any | ||
Straight microforcep | any | for manipulation of sealing tape. etc. | |
Acupuncture needle | any | e.g. from a pharmacy | |
Stereo microscope | any | for inspection of crystallization plates and crystal mounting, magnification up to 160X |