طريقة لقياس التمثيل الغذائي في التصنيف القطعان المجتمعات خلية مجمع عن طريق مستقر النظائر للبحث عن المفقودين
概要
This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.
Abstract
Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of “mock sorted” cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.
Introduction
الكائنات العليا تحتوي على مجتمعات معقدة من أنواع الخلايا المتميزة التي تتعاون لتحقيق المزيد من الوظائف المعقدة. على سبيل المثال، وأورام تحتوي ليس فقط الخلايا السرطانية، ولكن أيضا الخلايا الليفية، الخلايا التي تشكل الأوعية الدموية، والخلايا في كثير من الأحيان المناعة تتسرب 1؛ يحتوي الدم على خليط معقد من عشرات الأنواع الفرعية الخلايا المناعية 2. ويمكن أن تتألف حتى خطوط خلايا مستنبتة من القطعان متعددة، مثل اللمعية وفرعية القاعدية من خلايا سرطان الثدي 3. وعلاوة على ذلك، أنواع الخلايا المتميزة التي تتعايش يمكن أن تظهر الأيض "التعاون". على سبيل المثال، في الدماغ، ويعتقد أن الخلايا النجمية لتحويل الجلوكوز إلى اللاكتات، وهو بعد ذلك "تغذية" إلى الخلايا العصبية التي تؤكسد هذه الركيزة 4؛ اللمفاويات التائية هي في بعض السياقات التي تعتمد على الخلايا الجذعية المجاورة كمصدر للالسيستين 5؛ والخلايا السرطانية قد تتعاون مع أسوالليفية ciated في الأورام 6. لفهم سلوك الأيض مثل هذه الأنظمة، لا بد من فصل وقياس الأنشطة الأيضية لمختلف أنواع الخلايا الحالية.
إلى حد بعيد الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع لفصل أنواع الخلايا غير مضان تنشيط الفرز الخلية. هذه الطريقة تنطبق على نطاق واسع، شريطة أن يكون نوع من الخلايا أو دولة من الفائدة يمكن أن يكون "المسمى" باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت والتعبير عن البروتينات الفلورية هندسيا، أو الأصباغ الأخرى. خيار واحد هو أن خلايا أنواع منفصلة في البداية من خلال فارز الخلية، وإعادة ثقافة أنواع الخلايا الفردية التي تم الحصول عليها، ثم قم بإجراء دراسات التمثيل الغذائي لهذه الثقافات 7. ومع ذلك، وهذا أمر ممكن فقط إذا كان نوع من الخلايا أو النمط الظاهري مستقرة في ظروف ثقافة، ولا يمكن التقاط السلوك عابرة مثل دول دورة الخلية، ولا التعاون الأيض في المشترك الثقافات. لمثل هذه الحالات، يجب أن تقاس عملية التمثيل الغذائي مباشرة على ذلكخلايا rted. هذا هو التحدي منذ الخلية فرز إجراء تخضع خلايا للضغوط التي قد تشوه عملية الأيض لديهم 8، ونحن ندرك فقط عدد قليل من الدراسات اتخاذ هذا النهج 9 و 10. على وجه الخصوص، وجدنا أن نواتج رئيسية مثل الأحماض الأمينية قد تسرب من خلايا أبقى في الخلية فرز العازلة، بحيث قياسات وفرة الأيض المطلقة لم تعد موثوقة 11 (على الرغم من أن المقارنة النسبية بين كسور فرزها قد يكون لا يزال قيما).
للتحايل على هذه القضايا، ونحن تسمية الخلايا مع نظائر مستقرة قبل الفرز، والتركيز على أجهزة الإنترنت النقالة في الأيض الخلوية، بدلا من وفرة الأيض. منذ تتشكل أجهزة الإنترنت النقالة على مدى فترات زمنية أطول، ينبغي أن تكون أقل تأثرا التعرض على المدى القصير لشروط الفرز. نحن قياس أجهزة الإنترنت النقالة باستخدام كامل المسح الضوئي عالية الدقة الطيفي، وهي حساسة بما يكفي لتوفير داتا على مئات من المركبات بدءا من حوالي 500،000 خلايا فرزها، والتي تتطلب حوالي 30-60 دقيقة من الخلايا وقت الفرز. مقارنة بين "وهمية فرز" السيطرة (خلايا مرت الصك خلية فارز دون النابضة أية مجموعة من السكان معين) واستخراج المستقلب مباشرة من يرصد الطبق الثقافة للتأكد من أن أجهزة الإنترنت النقالة المرصودة هي تمثيلية من تلك الموجودة في الثقافة الأصلية. اعتمادا على اختيار استشفاف النظائر المستقرة، ومختلف المسارات الأيضية يمكن دراستها مع هذا الأسلوب.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويستند طريقتنا على مبدأ أن أجهزة الإنترنت النقالة في الأيض الخلوية تعكس "التاريخ" من الأنشطة الأيضية للخلية. هذا يجعل من الممكن للتحقيق في الأنشطة الأيضية في حيوانية من الخلايا، لأنها وقعت في المجتمع المعقدة من الخلايا، قبل الخلية إجراء الفرز. في المقابل، مناط?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Anas Kamleh for valuable help with optimizing mass spectrometry methods, and Annika von Vollenhoven for assistance with cell sorting. This research was supported by the Swedish Foundation for Strategic Research (grant no. FFL12-0220) and the Strategic Programme in Cancer Research (IR, RN); the Swedish Heart-Lung Foundation (CEW, HG); and Mary Kay Foundation (JW, MJ).
Materials
| HBSS | Sigma | H6648 | |
| INFLUX (inFlux v7 Sorter) | BD Biosciences | ||
| U-13C-Glucose | Cambridge isotopes | 40762-22-9 / GLC-018 | |
| U-13C,15N2-Glutamine | Cambridge isotopes | CNLM-1275-H-0.1 | |
| Methanol (JT Baker), HPLC grade | VWR | BAKR8402.2500 | |
| Ultrafree – MC – VV centrifugal Filters. Durapore PVDF 0.1 µm | Millipore | UFC30VV00 | |
| Ultimate 3,000 UHPLC | Thermo Fisher scientific | ||
| Q-Exactive Orbitrap Mass spectrometer | Thermo Fisher scientific | ||
| Merk-Sequant ZIC HILIC column (150 mm x 4.6 mm, 5 µm) | Merck KGaA | 1.50444.0001 | |
| Merk-Sequant ZIC HILIC guard column (20×2.1 mm) | Merck KGaA | ||
| Acetonitrile Optima LC-MS, amber glass | Fisher Scientific | A955-212 | |
| Milli-Q water | Millipore | Produced with a Milli-Q Gradient system | |
| MYRSYRA 99.5% OPTIMA (Formic acid) | Fisher Scientific | 11423423 | |
| X100 Screw Vial 1.5ml, 8-425 32×11.6mm,amber, 100 units | Thermo Fisher scientific | 10560053 | |
| X100 LOCK SKRUV VITT PTFE PACKNING 8-425 (Screw caps) | Thermo Fisher scientific | 12458636 | |
| ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix | Sigma-Aldrich | MSCAL5 | Calibration kit |
| SNAKESKIN 10K MWCO | Thermo Fisher scientific | 88245 | |
| Mathematica v.10 | Wolfram Research |
参考文献
- Gregersen, P. K. Cell type-specific eQTLs in the human immune system. Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).
- Heppner, G. H. Tumor heterogeneity. Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).
- Prat, A., et al. Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes. Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).
- Magistretti, P. J., Allaman, I. A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging. Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).
- Angelini, G., et al. Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).
- Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).
- Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis. Virology. 415 (2), 153-159 (2011).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Moussaieff, A., et al. High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).
- Johnson, C., et al. A metabolic signature of colon cancer initiating cells. Cancer Metab. 2, 32 (2014).
- Roci, I., et al. Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells. Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).
- Shapiro, H. . Practical flow cytometry. , (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Noack, S., Wiechert, W. Quantitative metabolomics: A phantom. Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).
