Estudio comparativo de los métodos de entrega de fármacos dirigidos a la oreja del ratón interno: Bullostomy<em> vs.</em> Inyección transtimpánicos

Asegúrese de que los procedimientos de manejo de animales están en conformidad con las regulaciones internacionales y nacionales. El protocolo sigue el RD Comunidad Europea 2010/63 / UE y española 53/2013 directrices, respectivamente. Manipulación 1. Animal general Los ratones de alimentación ad libitum con una dieta estándar y agua potable. Control de la salud y el bienestar siguiendo Federación de Asociaciones de Animales de Laboratorio de Ciencias (FELASA) recomendaciones. Evaluación 2. Audiencia NOTA: Pista impacto funcional de los procedimientos de microcirugía de audiencia antes de la prueba y muchas veces después de la cirugía (en este trabajo 2, 7, 14 y 28 d postmicrosurgery) con procedimientos no invasivos como la ABR 9. Para la prueba de ABR, anestesiar los ratones con protocolos de efecto de corta duración, es decir, inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg de peso corporal (BW) y xilazina (10mg / kg, BW). Alternativamente, realizar pruebas de audición bajo anestesia inhalante. NOTA: Como parámetros ABR pueden ser influenciados por el protocolo anestésico 28, utilizar el mismo durante todo el experimento. Comprobar la profundidad de la anestesia mediante el ensayo del reflejo del dedo del pie-pellizco. NOTA: Cuando el reflejo de retirada desaparece, el animal ha alcanzado una profundidad apropiada de la anestesia para realizar la prueba de audición. Proteger los ojos de la desecación y la queratoconjuntivitis sicca secundaria por la administración tópica de los suplementos de lágrimas, tales como geles a base de hidroxipropilmetilcelulosa. Mantenga el ratón a temperatura fisiológica (37,5-38 ° C) durante todo el procedimiento. Para evitar interferencias eléctricas, utilizar una bomba de agua caliente y calentadores. Monitorear la temperatura del cuerpo con sondas rectales. Siempre tenga cuidado de no sobrecalentar el animal. NOTA: Se recomienda limpiar la almohada eléctrica con un desinfectante de superficies entre los ratones.0; Para la inducción de la anestesia y la recuperación, almohadillas eléctricas, luces incandescentes o infrarrojos se puede utilizar. procedimiento ABR NOTA: Para el registro ABR, utilice una estación de trabajo de ordenador con una tarjeta de sonido hacia el interior para crear formas de onda (de digital a analógico, salida de DA, conversión) y digitalizar formas de onda de respuesta eléctrica (analógica para, de entrada AD digital), un atenuador, un osciloscopio y una amplificador de baja impedancia. Estaciones de trabajo auditivos modernos (es decir, Tucker Davis Techonologies) incluyen todos estos componentes en un único sistema compacto. Coloque el ratón anestesiado en posición boca abajo sobre las almohadillas de calor dentro de una cámara de atenuación de sonido para evitar la interferencia de ruido ambiente y la reverberación (Figura 1). Entregar estímulos acústicos en el conducto auditivo externo. Utilizar estímulos preestablecidas o nuevas señales diseñados con el software apropiado. Conectar la salida de la estación de trabajo DA para el altavoz seleccionado. NOTA: Frealtavoces de campo E o-campo cerrado insertados en el conducto auditivo externo se podrían utilizar. El primero son los preferidos cuando se trabaja con los ratones debido a la dificultad en la inserción de la sonda y la calibración del sonido en sistemas cerrados. altavoces de campo libre estimulan ambos oídos y provocan una respuesta binaural. Para obtener respuestas predominantemente monoaural con altavoces de campo libre, la actividad contralateral tiene que ser eliminado por la oclusión (es decir, con tapones para los oídos) o enmascarando el ruido. Coloque el altavoz de campo libre a una distancia fija (normalmente 5 a 20 cm) frente a la cabeza o la oreja seleccionado con el centro del altavoz alineado con el conducto auditivo externo. Asegúrese de que no hay obstáculos entre el altavoz y el oído y que el pabellón auricular está completamente abierta. Coloque electrodos de aguja subdérmicos de acero inoxidable de la siguiente manera: i) el activo) electrodo (positivo en el cuero cabelludo entre las orejas (sobre el vértice del cráneo), ii) el electrodo de referencia (negativo), en la parótidaregión por debajo del pabellón de la oreja, y iii) el electrodo de tierra en la región de la extremidad hacia atrás, cola o trasera (Figura 1). Compruebe la impedancia eléctrica en los electrodos positivos y negativos. Asegúrese de que la impedancia es inferior a 3 kOhm (idealmente 1 kOhm). Si es mayor, cambie de posición, limpia con alcohol o sustituir los electrodos. Para la grabación ABR, generar clics de banda ancha y frecuencias de tonos puros y presente en la disminución partir de intensidades el 90 a 10 dB con relación al nivel de presión sonora (SPL) de 5-10 dB SPL pasos 27, 29, 30. Presente breve clic o ráfaga de tono de estímulos (1-5 ms) que comienzan con alto nivel (es decir, 80 o 90 dB SPL) y la reducción de la intensidad de 5-10 dB SPL. Registrar la respuesta eléctrica en los primeros 10 ms después de la estimulación (ABR respuestas evocadas parecen a 6-8 ms). NOTA: Para esta razón, las tasas de estimulaciónno debe ser mayor de 50 estímulos / s (velocidad normal 20-50). Amplificar, grabar y promediar la respuesta eléctrica evocada a cada estímulo e intensidad. Utilizar un amplificador con bajo nivel de ruido y una buena relación señal-ruido, y conectarlo a la entrada de AD. NOTA: ABR tienen amplitudes muy bajas, típicamente por debajo de 1 mV (pico a pico) y deberán registrarse utilizando un amplificador con muy bajo nivel de ruido. En ratones con audición normal, las ondas ABR surgen claras después de un promedio de 100 – 200 respuestas, sin embargo para obtener grabaciones de alta calidad, o en el caso de la discapacidad auditiva, se recomiendan más repeticiones (750-1.000) 27. determinar visualmente el umbral de ABR durante la prueba. NOTA: El umbral de ABR es la más baja intensidad de los estímulos de sonido que provoca una ABR fiable de grabación con las ondas I a IV claramente visible y media tensión 2 SD-pico a pico por encima de la actividad de fondo media 31. Estos datos tienen que ser confirmadas dusonar análisis fuera de línea, junto con otros parámetros, incluyendo el pico y interpicos latencia, y la onda amplitudes. Realizar análisis de datos, ya sea manual o automáticamente. Para el análisis manual, identificar las ondas 4-5 ABR (I, II, III, … etc.) Y la marca de los picos (P1, P2, P3 …) y los valles (N1, N2, N3 …) para cada ciclo. Una vez que el análisis se ha completado, exportar datos a una hoja de cálculo o archivo de texto. NOTA: El software específico para la grabación de respuesta eléctrica general lleva a cabo el análisis de forma automática. Mediciones adicionales se pueden determinar en la grabación ABR en respuesta a una intensidad fija (es decir, 70 o 80 dB SPL) o en las intensidades relativas a los umbrales clic individuales (es decir, 15 dB SPL por encima del umbral). Realizar el análisis estadístico de los datos ABR utilizando el software apropiado. Dependiendo del diseño experimental, el uso estándar emparejado T-test o análisis de la varianza (ANOVA) para comparar principal pará ABRtros en los diferentes grupos 26, 30. NOTA: En los estudios longitudinales, muchos datos funcionales se recogen del mismo animal en diferentes puntos temporales (es decir, antes y después de la microcirugía). En este caso, un modelo de prueba repetida medida lineal general proporciona un análisis detallado de la varianza. 3. Preparación del vehículo Preparar y utilizar soluciones de vehículos en condiciones estériles. NOTA: Las soluciones líquidas suelen desaparecer rápidamente a través de la trompa de Eustaquio. Diferentes sistemas de administración de inyectables se podrían utilizar para aumentar el tiempo de residencia del fármaco en el oído medio, incluyendo los hidrogeles y nanopartículas 32. Para preparar CGP-hidrogel, se disuelven 75% quitosano desacetilado en ácido acético 0,2 M dando una solución de quitosano 1,5-2% (peso / peso). Añadir 9% glicerofosfato (peso / peso) a esta solución 7. Preparar la soluciónjusto antes de la administración y almacenar el hidrogel a 4 ° C hasta su uso. NOTA: El CGP-hidrogel es moderadamente viscosa pero aún inyectable a esta temperatura. A continuación 4 ° C cambia a una fase sólida, el bloqueo de su aplicación. Después de la aplicación, CGP sufre una transición de fase a un gel semi-sólido en aproximadamente 15 min a 37 ° C. Alícuota (0,5 ml) de tampón RL comercial y se almacena a 4 ° C hasta su uso. 4. Los procedimientos de microcirugía Inducir la anestesia general con combinaciones a base de ketamina de sedantes y analgésicos (es decir, la ketamina 100 mg / Kg, medetomidina 0,05 mg / Kg y phentanile 0,025 mg / Kg) por inyección intraperitoneal, seguido de agentes inhalantes (es decir, isoflurano). Después de la administración de agentes inyectables, ajustar la máscara anestésica para el hocico del ratón y conecte el suministro de O2 al vapor de isoflurano. Mantener la anestesia por inhalación durante elmicrocirugía y supervisar el plano anestésico con el reflejo del dedo del pie-pellizco y patrón de respiración. Comenzar la preparación quirúrgica cuando el reflejo es totalmente abolida y el ratón presenta una respiración regular. Mantener la temperatura del cuerpo con almohadillas de calor durante todo el procedimiento y proteger los ojos de la queratitis corneal con un gel a base de hidroxipropilmetilcelulosa. Preparar un área quirúrgica limpia mediante el uso de paños estériles. Esterilizar los instrumentos de microcirugía con un esterilizador de cuentas de cristal antes de la cirugía. Mantener condiciones estériles durante todo el procedimiento quirúrgico (guantes estériles, cortinas, instrumentos quirúrgicos, etc.). Microcirugía Bullostomy NOTA: Bullostomy es un procedimiento unilateral. Operar una oreja del ratón y utilizar el oído contralateral como control. Coloque el ratón en una posición de decúbito supino. Preparar el área quirúrgica en la superficie ventral del cuello usando las podadoras dequitar la piel. Limpiar la piel con una solución antiséptica a base de povidona yodada, y se cubre con paños estériles. El uso de un bisturí, hacer una incisión longitudinal de 2 cm de la mandíbula hasta la clavícula. Bajo magnificación con un microscopio quirúrgico, identificar las glándulas submandibulares y separar ambos con fórceps. Retraer las glándulas submandibulares y localizar el origen del músculo digástrico y el nervio facial. Hacer una incisión en el origen del músculo digástrico con unas tijeras, y retractarse ventralmente, la exposición de la cara inferior-medial subyacente de la bulla timpánica. Hacer una abertura en la bulla mediante la perforación en ella con una aguja de 27 G (Figura 2A). Localizar la arteria estapedial y la membrana caudal RW a ella (Figura 2B). Limpiar la sangre de la zona de taladrado con una esponja de gelatina absorbible. El uso de un catéter G 34 y una jeringa de vidrio micro, inyectar lentamente 3-5 μL de solución de vehículo (CGP-hidrogel o RL) a través del bullostomy directamente en el nicho RW, llenándolo (Figura 2C). Sellar el bullostomy con 1-2 gotas de adhesivo tisular. Devolver las glándulas submandibulares a su posición inicial y cerrar las incisiones en la piel con sutura quirúrgica seda 5-0. Aplicar un antiséptico alrededor de la incisión para evitar la infección de la herida a base de clorhexidina. NOTA: Las suturas absorbibles y no absorbibles se podrían utilizar. Las suturas no absorbibles deben ser removidos en 2 semanas. Seda no se recomienda para el cierre de la piel ya que su uso está asociado con la infección de la incisión y las reacciones tisulares locales. transtimpánico inyección bilateral Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral y preparar un área quirúrgica aséptica por debajo del meato auditivo externo como se describe en 4.3.1.1. Hacer una incisión de 0,5 cm longitudinal en la parte vertical del conducto auditivo externo cerca del trago y sección del pliegue cutáneo interno del pabellón auricular (opcional). Ubicar la membrana timpánica en el extremo del canal auditivo externo utilizando un microscopio de operación (Figura 2E) e identificar la pars superiores flaccida y la pars inferiores tensa, que se divide en secciones anterior y posterior por el mango del martillo (Figura 2F) . Hacer un pequeño myringostomy en la porción caudal de los flaccida pars. Hacer una incisión adicional en la pars tensa de la membrana timpánica, para permitir la evacuación del aire durante la inyección 33. Inyectar suavemente 10 a 15 l de vehículo (CGP-hidrogel o RL) solución con una jeringa de vidrio micro conectado a un catéter 34 G a través de la pars flaccida, cerca del nicho RW hasta el oído medio es claramente lleno. Cerrar las incisiones en la piel con una sutura quirúrgica seda 5-0 y limpio como se describe en 4.3.1.7. Coloque el ratón sobre su otro lado y opercomió la oreja contralateral (pasos 4.3.2.1 a 4.3.2.5). Mantenga el ratón sobre una almohadilla caliente hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Supervisar la condición corporal, la actividad y la presencia de signos de dolor o el estrés. Proporcionar analgésicos si es necesario (es decir, buprenorfina 0,05 mg / kg, carprofeno 5-10 mg / kg). Revisar la herida quirúrgica diaria y retirar los cierres de la piel después de la operación 7-14 días después de verificar que la herida ha sanado. 5. Evaluación morfológica de Coclear arquitectura celular La eutanasia el ratón al final del experimento (en este trabajo 28 días postmicrosurgery), con una sobredosis de pentobarbital intraperitoneal (100 mg / kg) para estudiar los efectos a largo plazo de la cirugía. Realizar una perfusión transcardial de frío 0,1 M de fosfato bufferSaline (PBS), pH 7,5, seguido de 4% (v / p) de paraformaldehído (PFA) en PBS 0,1 M, pH 7,5 como se describe 26. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es altamente tóxico; evitar el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas. Evitar respirar el polvo durante la medición y preparación. Use un microscopio estereoscópico para diseccionar el oído interno del hueso temporal como se describe 34, 35 sin separar el vestibular y coclear componentes del oído interno. Fijar el oído interno aislado con 4% (p / v) PFA en 0,1 M PBS, pH 7,5 a 4 ° C durante 12 h con agitación suave. Lavar 3x durante 5 minutos con 0,1 M PBS, pH 7,5. Descalcificar las muestras con ácido etilendiaminotetraacético 10% (EDTA) preparado en 0,1 M PBS, pH 6,5 a 4 ° C durante 10 d, con agitación constante, el cambio de la solución de EDTA cada 3 d. Cuando cochleae adquirir una consistencia suave, eliminar el EDTA y lavar 3 veces durante 5 minutos con 0,1 M PBS, pH 7,5, wiTH agitación a RT. Incrustar las muestras en cera de parafina como se describe 34 y hacen 7 m de espesor secciones paralelas a la cocleares modiolo. Para evaluar la arquitectura celular coclear, secciones de tinción con hematoxilina y eosina (H & E) 30 y el uso de un microscopio de luz conectado a una cámara digital para capturar imágenes con 4X y 20X lentes. 6. Expresión Génica coclear Limpiar la superficie de trabajo y los instrumentos quirúrgicos con una solución de descontaminación ARNasa. La eutanasia el ratón como se describe en 5.1 y rápidamente diseccionar el oído interno del hueso temporal usando un microscopio. Sumergir el oído interno en un recipiente de vidrio que contiene ácido ribonucleico protector (RNA) y reactivo estabilizador. Retire el peñasco que queda con unas pinzas de joyero y separar suavemente la cóclea desde el vestíbulo con una tijera de los ojos de Vanna 35. inmediatamente transfer la cóclea en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con 80 solución protector y estabilizador de ARN l y congelar el tejido colocando el tubo en hielo seco. Preservar muestras cocleares a -70 ° C hasta su uso. Aislar el ARN coclear como se describe 35 y determinar su calidad y cantidad por espectrofotometría. Generar cDNA coclear de cantidades iguales de RNA total de ratón utilizando un kit comercial de transcripción inversa. Realizar QRT-PCR para amplificar el ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) por triplicado para medir las transcripciones de genes 35, 36. NOTA: En este pro- trabajo y las transcripciones de genes anti-inflamatorios de IL1B, IL6, TGFB1, TNFa, IL-10 y dusp1 se midieron. Calcular los coeficientes relativos de expresión mediante la normalización de los niveles de umbral de ciclo objetivo transcripción (TC) a la media aritmética del nivel del gen de referencia y la cuantificación relativa mediante la normalización de laproblemas en grupo los niveles de transcripción a la media aritmética del grupo calibrador 37.