Een vergelijkende studie van Drug Delivery Methoden Gericht op de Mouse Inner Ear: Bullostomy<em> Versus</em> Transtympanic Injection

Zorg ervoor dat de procedures dier handling zijn in overeenstemming met de internationale en nationale regelgeving. Het protocol volgt de Europese Gemeenschap 2010/63 / EU en de Spaanse RD 53/2013 richtlijnen, respectievelijk. 1. Algemeen Animal Handling Feed muizen ad libitum met een standaard dieet en het drinken van water. gezondheidsinspectie en welzijn door het volgen van Federatie voor Proefdierkunde Associations (FELASA) aanbevelingen. 2. Hoorzitting Assessment OPMERKING: Spoor functionele gevolgen van microchirurgische procedures testen gehoor voor en vaak na operatie (in dit werk 2, 7, 14 en 28 d postmicrosurgery) met niet-invasieve procedures, zoals ABR 9. ABR testen verdoven muizen met korte werkingsduur protocollen dwz intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht (BW) en xylazine (10mg / kg BW). Als alternatief, het uitvoeren van het gehoor testen onder inhalatie-anesthesie. OPMERKING: Omdat ABR parameters kunnen worden beïnvloed door verdoving protocol 28, gebruiken de zelfde gedurende het experiment. Controleer de diepte van de anesthesie door het testen van de teen-snuifje reflex. OPMERKING: Wanneer de terugtrekking reflex verdwijnt, heeft het dier een geschikte diepte van anesthesie bereikt auditieve testen uit te voeren. Bescherm de ogen tegen uitdroging en secundaire keratoconjunctivitis sicca door lokale toediening van traan supplementen, zoals hydroxypropyl-methylcellulose gebaseerde gels. Houd de muis bij fysiologische temperatuur (37,5-38 ° C) gedurende de gehele procedure. Om elektrische interferentie te voorkomen, gebruikt u een warm water pomp en verwarming pads. Bewaaklichaam temperatuur rectale sondes. Wees altijd voorzichtig het dier niet oververhit raken. LET OP: Wij adviseren het schoonmaken van de verwarming pad met een oppervlakte desinfectiemiddel tussen muizen.0; Voor de anesthesie inductie en herstel, elektrische verwarming pads, gloeilampen of infrarood licht kan worden gebruikt. ABR procedure LET OP: Voor ABR registratie, gebruik maken van een computer werkstation met een inboard geluidskaart golfvormen te maken (digitaal naar analoog, DA output, conversie) en elektrische reactie golfvormen digitaliseren (analoog naar digitaal, AD-ingang), een demper, een oscilloscoop en een lage impedantie versterker. Modern auditieve werkstations (dwz Tucker Davis Techonologies) omvat al deze componenten in één compact systeem. Plaats de verdoofde muis in buikligging de verwarming pads in een geluiddempende kamer naar omgevingsgeluid interferentie en nagalm (figuur 1) te vermijden. Lever akoestische stimuli in de uitwendige gehoorgang. Gebruik vooraf ingestelde stimuli of nieuwe signalen ontworpen met de juiste software. Sluit de DA-werkstation output naar de geselecteerde luidspreker. LET OP: Free-veld of gesloten veld luidsprekers in de uitwendige gehoorgang ingebracht kan worden gebruikt. Eerstgenoemde hebben de voorkeur bij het werken met muizen vanwege de moeilijkheid opnemers en insertie van het geluid in gesloten systemen. Vrij veld speakers stimuleren beide oren en wekken een binaural reactie. Overwegend mono reacties met vrije veld speakers te verkrijgen, contralaterale activiteit moet worden geëlimineerd door occlusie (dwz met oordopjes) of door het maskeren van het lawaai. Plaats lege veld spreker op een vaste afstand (gewoonlijk 5-20 cm) naar het hoofd of oor gekozen met het midden van de luidspreker uitgelijnd met de uitwendige gehoorgang. Zorg ervoor dat er geen obstakels zijn tussen de spreker en het oor en de oorschelp wordt volledig geopend. Plaats roestvrijstalen subdermale naald elektroden als volgt: i) de actieve (positieve) elektrode in de hoofdhuid tussen de oren (over de top van de schedel), ii) de referentie (negatieve) elektrode in de parotisgebied onder de oorschelp en iii) de aardelektrode in de rug, staart of achterpoot regio (Figuur 1). Controleer de elektrische impedantie in de positieve en negatieve elektroden. Zorg ervoor dat de impedantie is minder dan 3 kOhm (idealiter 1 kOhm). Als deze hoger is, verplaatsen, schoon met alcohol of vervang de elektroden. ABR opnemen genereren breedband klikken en zuivere toonfrequenties en aanwezig bij afnemende intensiteiten 90-10 dB ten opzichte van het geluidsdrukniveau (SPL) 5-10 dB SPL stappen 27, 29, 30. Present korte klik of toon burst stimuli (1-5 ms) beginnen met een hoog niveau (dat wil zeggen 80 of 90 dB SPL) en het verminderen van de intensiteit van 5-10 dB SPL stappen. Registreer de elektrische respons in de eerste 10 ms na de stimulatie (ABR opgewekte responsen verschijnen 6-8 ms). OPMERKING: Om deze reden, stimulatie tarievenmag niet hoger zijn dan 50 stimuli / s (normaal tarief 20-50). Versterken, opnemen en het gemiddelde van de opgewekte elektrische reactie op elke stimulus en intensiteit. Gebruik een versterker met weinig ruis en een goede signaal-ruisverhouding, en sluit deze aan op de AD-ingang. OPMERKING: ABR zeer lage amplitude, meestal onder 1 mV (piek-piek) en moeten worden geregistreerd met een versterker met een zeer laag geluidsniveau. In een normaal gehoor muizen, duidelijk ABR golven ontstaan na middeling 100-200 reacties, maar van hoge kwaliteit opnames te verkrijgen, of in het geval van slechthorendheid, meer herhalingen aanbevolen (750-1000) 27. Visueel de ABR drempel tijdens de test te bepalen. OPMERKING: De ABR drempelwaarde tarieven geluidsstimuli intensiteit die een betrouwbare ABR uitlokt opname met golven I tot IV duidelijk zichtbaar en middelgrote piek-piekspanning 2 SD boven de gemiddelde achtergrondactiviteit 31. Deze gegevens worden bevestigd during off-line analyse, samen met andere parameters zoals piek- en interpeak latency, en golf amplitudes. Voer data-analyse handmatig of automatisch. Voor handmatige analyse, het identificeren van de 4-5 ABR golven (I, II, III, … enz.) En teken de pieken (P1, P2, P3 …) en dalen (N1, N2, N3, …) voor elke golf. Zodra de analyse is voltooid, gegevens exporteren naar spreadsheet of tekstbestand. LET OP: Specifieke software voor elektrische respons opname voert meestal de analyse automatisch. Aanvullende metingen kunnen worden bepaald in het ABR opname in reactie op een bepaalde intensiteit (bijvoorbeeld 70 of 80 dB SPL) of intensiteiten ten opzichte van individuele drempels klik (dwz 15 dB SPL overschrijdt drempel). Voer statistische analyse van ABR gegevens met behulp van de juiste software. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp, gebruik standaard gepaarde T-test of een analyse van de variantie (ANOVA) om te vergelijken belangrijkste ABR parameters in de verschillende groepen 26, 30. LET OP: In longitudinale studies, zijn veel functionele gegevens verzameld van hetzelfde dier op verschillende temporele punten (dat wil zeggen vóór en na microchirurgie). In dit geval, een algemeen lineair model herhaalde meting test geeft een gedetailleerde variantieanalyse. 3. Vehicle Voorbereiding Voor te bereiden en te gebruiken voertuig oplossingen onder steriele omstandigheden. LET OP: Vloeibare oplossingen zijn meestal snel opgelost door middel van de buis van Eustachius. Verschillende injecteerbare afgiftesystemen kunnen worden gebruikt om de verblijftijd van het geneesmiddel te verhogen in het middenoor, zoals hydrogels en 32 nanodeeltjes. Om CGP-hydrogel bereiden lossen 75% gedeacetyleerd chitosan in 0,2 M azijnzuur waardoor een 1,5-2% (gew / gew) chitosan oplossing. Voeg 9% glycerofosfaat (w / w) aan deze oplossing 7. Bereid de oplossingvlak voor toediening en bewaar de hydrogel bij 4 ° C tot gebruik. OPMERKING: De CGP-hydrogel matig viskeuze maar injecteerbare bij deze temperatuur. Onder 4 ° C verandert naar een vaste fase, het blokkeren van de toepassing. Na het aanbrengen CGP ondergaat een faseovergang naar een halfvast gel in ongeveer 15 minuten bij 37 ° C. Aliquot (0,5 ml) commercieel RL buffer en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. 4. Microchirurgie Induceren algemene anesthesie met ketamine gebaseerde combinaties sedativa en analgetica (bijvoorbeeld ketamine 100 mg / kg, medetomidine 0,05 mg / kg en phentanile 0,025 mg / kg) door intraperitoneale injectie, gevolgd door inhalatie middelen (bijv isofluraan). Na het toedienen van injecteerbare middelen, past de verdoving gezichtsmasker om de muis snuit en sluit de O2 levering aan isofluraan damp. Handhaving van de inhalatie-anesthesie tijdens demicrochirurgie en bewaken van de verdoving vliegtuig met de teen-snuifje reflex en ademhaling. Begin chirurgische voorbereiding als de reflex is volledig afgeschaft en de muis presenteert regelmatige ademhaling. Handhaving van de lichaamstemperatuur met verwarming pads gedurende de gehele procedure en de ogen te beschermen tegen het hoornvlies keratitis met een hydroxypropyl-methylcellulose gebaseerde gel. Bereid een schone chirurgische gebied met behulp van steriele doeken. Steriliseer de microchirurgische instrumenten met een glazen kraal sterilisator voorafgaand aan de operatie. Handhaaf steriele omstandigheden tijdens de hele chirurgische procedure (steriele handschoenen, doeken, chirurgische instrumenten, enz.). microchirurgie Bullostomy LET OP: Bullostomy is een eenzijdige procedure. Bedien een oor van de muis en gebruik de contralaterale oor als controle. Plaats de muis in een decubitus rugligging. Bereid de chirurgische gebied aan de ventrale oppervlak van de nek met behulp van klippers aanVerwijder de vacht. Reinig de huid met povidonjood gebaseerde antiseptische oplossing, en bedek het met steriele doeken. Met behulp van een scalpel een longitudinale incisie 2 cm vanaf de onderkaak tot de clavicula. Onder vergroting met een chirurgische microscoop, identificeren de submandibulaire klieren en scheiden beide met een pincet. Trek de onderkaakspeekselklier en lokaliseren van de oorsprong van de musculus digastricus en het gezicht zenuw. Een insnijding in de oorsprong van de musculus digastricus met een schaar, uitlopen en ventraal, waardoor de onderliggende inferieure mediale zijde van het trommelvlies bulla. Maak een opening in de bulla door boren in met een 27 G naald (Figuur 2A). Lokaliseren stapediale slagader en RW membraan caudaal (figuur 2B). Reinig het bloed uit de geboorde ruimte met een absorbeerbare gelatine spons. Met behulp van een 34 G catheter en een glas micro-injectiespuit en injecteer langzaam 3-5 μL vehikeloplossing (CGP-hydrogel of RL) via bullostomy direct op de RW niche, te vullen (Figuur 2C). Sluit de bullostomy met 1-2 druppels van weefsel lijm. Zet de onderkaakspeekselklier naar hun oorspronkelijke positie en sluit de huid insnijdingen met 5-0 zijden chirurgisch hechtdraad. Breng een chloorhexidine gebaseerd antiseptische rond de incisie te vermijden wondinfectie. OPMERKING: absorbeerbare en niet resorbeerbare hechtingen worden gebruikt. Niet absorbeerbare hechtingen worden verwijderd in 2 weken. Zijde wordt niet aanbevolen voor de sluiting huid omdat het gebruik ervan wordt geassocieerd met incisie infectie en lokale weefselreacties. Bilaterale transtympanic injectie Plaats de muis in de laterale decubitus positie en bereidt een aseptische chirurgische gebied onder de externe gehoorgang zoals beschreven in 4.3.1.1. Voeg een 0,5 cm longitudinale incisie in het verticale deel van de uitwendige gehoorgang dichtbij de tragus en seel de interne cutane vouw van de oorschelp (optioneel). Zoek het trommelvlies aan het eind van de uitwendige gehoorgang met een chirurgische microscoop (Figuur 2E) en identificeert de bovenste pars flaccida en de inferieure pars tensa, die in voorste en achterste gedeelten verdeeld door het handvat van de hamer (figuur 2F) . Maak een kleine myringostomy in het caudale deel van de pars flaccida. Maak een extra incisie in de pars tensa van het trommelvlies, de lucht evacuatie mogelijk te maken tijdens de injectie 33. Injecteer voorzichtig 10-15 uL drager (CGP-hydrogel of RL) oplossing met een glazen micro injectiespuit verbonden met een 34 G katheter door de pars flaccida, dicht bij de RW nis totdat het middenoor duidelijk vol. Sluit de huid insnijdingen met een 5-0 zijden chirurgisch hechtdraad en schoon zoals beschreven in 4.3.1.7. Plaats de muis op de andere kant en operaten de contralaterale oor (stappen 4.3.2.1 tot 4.3.2.5). Houd de muis op een verwarmingselement, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug. Controleer de conditie, de activiteit en de eventuele tekenen van pijn of spanning. Analgetica leveren indien nodig (dat wil zeggen Buprenorfine 0,05 mg / kg, Carprofen 5-10 mg / kg). Geef je mening over de chirurgische wond dagelijks en verwijder de huid sluitingen 7-14 dagen na de operatie na te hebben vastgesteld dat de wond genezen is. 5. morfologische Evaluatie van Cochlear cytoarchitecture Euthanaseren de muis aan het einde van het experiment (in dit werk 28 dagen postmicrosurgery), met een intraperitoneale overdosis pentobarbital (100 mg / kg) aan de lange termijn van de operatie te bestuderen. Voer een transcardial perfusie met koude 0,1 M fosfaat-gebufferdZoutoplossing (PBS), pH 7,5, gevolgd door 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PBS, pH 7,5 zoals beschreven 26. LET OP: Paraformaldehyde is zeer giftig; contact met de huid, ogen of slijmvliezen te voorkomen. Vermijd het inademen van het poeder tijdens de meting en voorbereiding. Gebruik een stereomicroscoop om ontleden het binnenoor van het slaapbeen beschreven 34, 35 zonder scheiding van de vestibulaire en cochleaire componenten van het binnenoor. Bevestig de geïsoleerde binnenoor met 4% (gew / vol) PFA in 0,1 M PBS, pH 7,5 bij 4 ° C gedurende 12 uur onder zacht schudden. 3x wassen gedurende 5 min met 0,1 M PBS, pH 7,5. Ontkalken de monsters met 10% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bereid in 0,1 M PBS, pH 6,5 bij 4 ° C gedurende 10 d onder constant schudden, veranderen de EDTA elke 3 d. Wanneer cochleae een zachte consistentie te verwerven, te verwijderen EDTA en was 3x gedurende 5 min met 0,1 M PBS, pH 7,5, with schudden bij kamertemperatuur. Insluiten de monsters in paraffine zoals beschreven 34 en maak 7 pm dikke cochleaire secties parallel aan de modiolus. Om cochleair cytoarchitecture, vlek secties met hematoxyline en eosine (H & E) 30 te evalueren en gebruik een lichtmicroscoop verbonden met een digitale camera om beelden met 4X en 20X lenzen vast te leggen. 6. Cochlear Gene Expression Reinig het werkoppervlak en chirurgische instrumenten met RNase decontaminatie oplossing. Euthanaseren de muis, zoals beschreven in 5.1 en snel ontleden uit het binnenoor van het slaapbeen behulp van een microscoop. Dompel het binnenoor in een glazen schaaltje met ribonucleïnezuur (RNA) beschermer en stabilisator reagens. Verwijder het resterende rotsbeen met juwelier pincet en voorzichtig scheiden het slakkenhuis van de vestibule met behulp van Vanna's eye schaar 35. onmiddellijk transfer het slakkenhuis in een 2 ml microcentrifugebuis met 80 pi RNA beschermer en stabilisator oplossing en vries het weefsel door het plaatsen van de buis in droogijs. Behouden cochleair monsters bij -70 ° C tot gebruik. Isoleer cochleair RNA zoals beschreven 35 en de kwaliteit en kwantiteit vast spectrofotometrisch. Genereer cochleair cDNA uit gelijke hoeveelheden van de totale muis RNA met behulp van een reverse transcriptie commerciële kit. Uitvoeren qRT-PCR aanvullende deoxyribonucleïnezuur (cDNA) amplificeren in drievoud gentranscripten 35, 36 te meten. LET OP: In dit werk pro- en anti-inflammatoire gen transcripties van Il1b, IL6, TGFB1, TNFa, Il10 en Dusp1 werden gemeten. Bereken relatieve expressie verhoudingen door het normaliseren doelwit transcript cyclus drempel (CT) niveau aan het rekenkundig gemiddelde van de referentie-gen niveau en de relatieve kwantificatie door het normaliseren van deprobleemgroep transcript niveaus aan het rekenkundig gemiddelde van de kalibrator groep 37.