Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.
이 내이에 도달 할 수 있도록 우리는 중이에 특정 약물 전달을위한 설치류에 두 개의 최소 침습 미세 수술 기법을 제시한다. 첫 번째 절차는 bullostomy 되나, 고막 수포의 천공으로 구성; 두번째는 transtympanic 주입된다. 모두 인간의 임상 고 실내 절차를 에뮬레이트.
키토산 – 글리세 (CGP) 및 Ringer's 젖산 버퍼 (RL)이 지역의 약물 전달 용 생체 적합성 차량으로 사용되었다. CGP 널리 의약 용도로 사용되는 무독성 생분해 성 중합체이다. 이것은 RT에서 점성 액체이지만 체온에서 반 고체상에 응결. RL은 인간에서 정맥 내 투여에 사용되는 등장 성 용액이다. 이 차량의 작은 부피를 정확하게 bullostomy 의해 원형 윈도우 (RW)의 틈새에 배치된다. transtympanic 주입 중이을 채우고 적은 제어하지만 내 귀에 폭 넓은 액세스 할 수 있습니다.
<p class = "jove_content"> 두 기법의 안전성 프로파일을 조사하고, 기능 및 형태 학적 시험을 사용하여 비교 하였다. 청각은 청각 뇌간 전에 응답 (ABR) 및 미세 후 여러 번 등록하여 평가 하였다. 인공 구조물의 cytoarchitecture 및 보존 수준은 파라 포름 알데히드 고정 및 탈회 인공 시료에서 기존의 조직 학적 기술에 의해 연구되었다. 병렬로 고정되지 않은 인공 샘플을 취하여 바로 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)에 의해 염증 마커의 유전자 발현 프로파일을 분석하는 냉동 하였다.transtympanic 주입 bullostomy에 비해 덜 침습적 인 것을 입증 있지만 두 절차는 마우스 중이에 약물 전달 방법으로 적합하다.
장애 청력 (가장 빈번한 인간의 감각 적자이며, 전 세계 인구의 5.3 %, 65 세 이상 개인의 30 %에 영향을 http://www.who.int/topics/deafness/en을 2016 업데이트). 청력 손실은 아이들의 언어 습득에 영향을 미치고 노인의인지 기능 저하를 가속화합니다. 따라서 엄청난 사회 경제적 영향을 중요한 건강 관리 문제입니다. 이것은 유전 적 결함, 환경 적 요인 또는 결국 달팽이관 손상 모발 세포 및 신경 세포의 사멸을 유도하는 양 (1)의 조합에 의해 발생 될 수있다. 이러한 세포 따라서 세포 손실과 동반 청력 손실이 되돌릴 수 없습니다, 포유 동물에서 재생되지 않습니다. 임상 옵션은 보청기와 인공 와우, 중이 및 골전도 임플란트 (2)를 포함하여 보철 장치를 기반으로합니다. 불행하게도, 어떤 특정 건강 회복 누 없다청각 장애에 대한 tments 따라서 여러 연구 라인은 예방 및 수복 치료의 개발에 초점을 맞추고있다. 새로운 치료 옵션이 약물 치료 2 유전자 및 세포 치료뿐만 아니라 작은 분자의 개발을 포함한다.
인공 약리학 적 치료에있어서 가장 중요한 문제 중 하나는 약물 전달된다. 전신 치료에 의한 혈관 미로 배리어 3 달팽이관의 유효성이 제한되어 있으므로, 내부 귀 약물 통로를 제한 내이 유체 항상성을 유지하는 물리적 및 생화학 장벽 역할 인공 혈관과 접촉하는 연속 내피. 투과성 이뇨제 또는 삼투 제의 사용과 같은 인공 염증 동안 증가 될 수 있지만 이는 단지 작은 지용성 분자 투과성이다. 결국 전신 투여 후에 감소 달팽이관 도달 할 약물의 양;따라서, 유기 독성을 일으킬 수 과다 복용이 필요합니다. 또한, 약물의 간 대사 독성 비활성 대사 4, 5, 6, 7을 제조 할 수있다. 대조적으로, 로컬 개입 바람직 부작용 4, 7, 8, 9없이 중간 또는 내이으로 약물의 공지 제한된 양의 배치를 허용한다. 현재 임상에서 고 실내 정부는 이러한 메니 에르 병 (10) 겐타 마이신과 같은 특정 인공 와우 병리, 제한되어, 갑작스런 난청의 코르티코 스테로이드, 메니 에르 병, 면역 매개 성 1, 13, 12, 11, 및 소음 난청갑작스런 난청 4, 16, 17 (4), (15) 및 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1).
지역 투여를위한 제제는 인공 와우 유체의 섬세한 항상성 (pH와 삼투압)을 유지해야한다. 또한, 뇌척수액의 세균 오염을 방지하기 위해 프로세스를 통해 멸균을 유지하는 것이 매우 중요하다. 약물 전달에 사용되는 부형제 nonototoxic, 생체 적절한 일관성이 있어야한다. 액체 솔루션 인해 이관을 통해 통관에 intracochlear 주사를 권장하지만, 고 실내 경로에 대한 적합하지 않습니다. 이 경우에, 약물은 일반적 중이 4 (18, 19)에서 자신의 보존성을 높이기 위해 반 – 고체 겔에 의해 수행된다. 대체 배달 등산용내이에 약물의 통과를 증가시키는 캐리어로서 사용 MS는 나노 입자 (20)이며, 여기서 21 아데노 우리는 두 차량 비교 : CGP 및 RL 용액. CGP 키토산에 의해 형성된 하이드로 겔 -D- 글루코사민 및 갑각류의 껍질로부터 얻은 N- 아세틸 -D- 글루코사민과 β-글리세 키토산 체인 주위 물 실드를 형성하고 그것을 유지하는 폴리올로 구성된 선형 다당류 액체 형태. CGP는 열성이고 중이 22, 23, 24, 25의 지속적인 약물 방출을 허용 lysozymes 의해 분해 될 수있다. 키토산 계 하이드로 겔 인해 면역 원성 및 염증 반응 지역 23, 24의 활성 부족 부족 그러한 약물 전달 임상 응용에 적합한 차량이다. O 번째에어 손, RL 버퍼는 특히 출혈, 외상에, 물과 전해질의 소스로 인간의 정맥 투여를위한 비 발열 등장 성 용액 (273 mOsm / L pH를 6.5) 또는 젖산 대사의 부산물로 인해 부상을 구울 간에서 산증을 중화.
여기에 우리가 설명하고 마우스 내 귀에 지역 약물 전달을위한 정제 된 두 가지 수술 방법을 비교한다. 두 기법의 안전성 프로파일은 기능적 형태 및 분자 시험을 사용하여 평가 하였다. 청력 청성 뇌간 반응 (ABR) (26) (27) 이전과 다른 시간에 미세 후에 수행을 사용하여 평가 하였다. 종료점 절차는 두 미세 수술 절차의 해부학 적 세포 및 분자 영향 달팽이관 해부와 비교하기 위해 사용 하였다.
내 귀에 지역 약물 전달은 중이 4, 19, 39 약물을 배치, 고 실내 투여에 의해 직접 intracochlear 주사 또는 간접적으로 수행 할 수 있습니다. Intracochlear 투여는 기저 대 정점 농도 기울기 및 클리어런스 유스타키오 관을 통해 창구 막을 통해 확산을 방지하고 통제 달팽이관 정확한 약물 전달을 제공한다. 그러나, 복잡하고 섬세한 미세 7 (39)이 필요한 높은 침습적 보통이다. 이러한 맥락에서, 산업은 지속적인 약물 방출 (40), (41)에 대한 새로운 코팅, 이식 장치를 개발하고있다. 한편, 고 실내 투여는 (D)의 큰 볼륨의 주입을 허용하는 최소 침습 및 수행하기 쉬운 절차약동학은 제어가 용이하지 않지만, 중이로 깔. 약물의 대부분은 유스타키오 관을 통해 클리어하고, 나머지 부분은 달팽이관 (18)에 도달하기 RW 막을 통해 확산한다. RW는 달팽이관 (7)의 외 림프 가득 고막 덕트에 중간 귀에서 물질의 최대 흡수의 사이트입니다. 투과성이 약물 특성 (크기, 농도, 용해도 및 전하)과 트랜스 교통 시스템 (확산, 능동 수송 또는 탐식) (42)에 의존하지만 그것은 반투과성 세 층 구조이다. 타원형 창 귀 캡슐은 달팽이관 (43), (44)에 대한 대안하지만 덜 효과적 입구입니다.
여기에 우리가 입증하고 표적 약물 마우스 중이로 전달을위한 두 개의 미세 수술 방법 비교 : bullostomy 및 transtympa을NIC 주입 절차. 이러한 절차에 대한 일반적인 중요한 단계를 포함한다 : I) 심리 평가 전과 미세 후, II)를 멸균 조건 하에서 균일 비히클 용액의 조제, ⅲ) 마취 절차 동물 체온 상수 모니터링주의 감독 IV 분자량 및 형태 학적 분석을 완료하기 위해 인공 샘플을 채취) 느린 RW 타겟팅 차량의 해당 볼륨의 배치 및 IV).
bullostomy위한 Retroauricular 복부 접근법, 45 (7)를 설명 하였다. 우리의 경험에 덜 병적 가져왔다과 RW (46)에 더 나은 액세스를 제공하기 때문에 우리는 복부 근사치를 사용했다. Transtympanic 주사는 일반적으로 동위 고막의 tensa을 통해 수행, 추골의 흉골 (12)에 전방 또는 후방. 에서이 작품은 우리가 주입시 공기 배출을 허용하도록 동위 tensa의 이전 추가 구멍과 추골 넘어 갈 거예요의 flaccida을 통해 기술, 주입의 변형을 수행 하였다.
모두 microsurgeries 빠른 (bullostomy 각각 transtympanic 접근 귀 당 20 및 5 분)이었다 있지만 transtympanic 주입은 짧은 수술 후 회복 시간없이 병적으로는 bullostomy보다 덜 침습적했다. 가장 중요한 두 절차 청각 유지되고 ABR 파라미터는 미세 전에 결정된 것과 동일 하였다. transtympanic 방법은 bullostomy보다 시간이 덜 걸리며 같은 개입 동안에 동일 동물의 양쪽 귀에서 수행 될 수있다. transtympanic 분사의 이점 필요한 경우는, 좌우 반복 수행 될 수 있음을 포함된다. 한편, RW bullostomy는 멤브레인에 직접 시각 액세스를 제공하고 filli 허용RW의 틈새의 NG. 반면, transtympanic 주사는 RW 틈새 차량 위치의 제어를 허용하지 않습니다.
이 연구에서보고 된 절차는 청력에이 독성 및 효능 평가의 평가로 사전 임상 응용 프로그램에 대한 중간 귀에 지역 약물 차량 전달을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 두 미세 절차는 특정 장점과 단점에 다른 방법을 제공하는 기술되어있다. 모두 청력 보존 및 형태 학적 변화가 발생하지 않습니다. 로컬 염증 bullostomy의 전위 합병증으로 설명한다. 보완 기술의 집합은 청각, 형태 학적 및 염증 마커 발현 평가를 포함하여 수술 후 절차에 대해 설명합니다. 이러한 기술에 대한 미래의 응용 프로그램은 동물 모델에서 유전자 세포 및 약물 학적 접근 방법을 포함하여 손실, 청각에 대한 새로운 치료법의 임상 평가를 포함한다. 고 실내의 administrat이온은 분명 인공 손상없이 외 림프로 통과를 용이 원형 창 막과 접촉, 중이에서의 치료의 전달을 보장한다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 기술 지원을위한 유전체학 및 비 침습 신경 기능 평가 시설 (IIBM, CSIC-UAM)을 감사드립니다. 이 작품은 스페인 "Ministerio 드 Economia y를 Competitividad"(FEDER-SAF2014-53979-R) 및 유럽 연합 (FP7-AFHELO와 FP7-PEOPLE-TARGEAR) IVN에의 보조금에 의해 지원되었다.
Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
Water pump | Gaymar | # TP472 | |
Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
Statistics software (SPSS) | IBM | ||
Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer |
Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour. |
Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
Pividone iodine based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
Microlance 27G | Becton Dickinson | # 302200 | |
Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
Catheter (Microfil 34G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |