针对鼠标内耳给药方法的比较研究：Bullostomy<em>对战</em>鼓室注射

确保动物的处理程序是按照国际和国家法规。该协议遵循欧共体六十三分之二千零十/欧盟和西班牙的RD二千零十三分之五十三指引，分别。 1.一般动物处理小鼠饲料自由采食与标准饮食和饮水。控制健康和福祉按照联邦实验动物科学协会（FELASA）的建议。 2.听力评估注意：手术后通过测试听力多次显微手术操作之前和跟踪功能的影响（在此工作2，7，14和28天postmicrosurgery）与非侵入性检查，如ABR 9。 对于ABR测试，麻醉持续时间短效果的方案，即小鼠腹腔注射氯胺酮（100毫克/公斤体重（BW）和甲苯噻嗪（10毫克/公斤，BW）。另外，执行吸入麻醉下听力测试。 注意：由于ABR参数可以由麻醉协议28的影响，使用同一个整个实验。 通过测试脚趾捏反射检查麻醉深度。 注意：当撤回反射消失，动物已经达到了麻醉的合适的深度进行听觉测试。 泪液补充，如羟丙基甲基纤维素基-凝胶局部给药防止脱水和继发性干燥性角结膜炎眼睛。 保持在生理温度（37.5-38℃）小鼠在整个过程中。为了避免电气干扰，用温水泵和加热垫。监测体温直肠探头。务必注意不要过热动物。 注：我们建议您用老鼠之间的表面消毒剂清洁加热垫。0;对于麻醉诱导和恢复，电热垫，白炽灯或红外线灯都可以使用。 ABR程序 注：对于ABR登记，使用计算机工作站的内侧声卡创建波形（数字到模拟，DA输出，转换）和数字化电响应波形（模拟到数字，AD输入），衰减器，示波器和低阻抗放大器。现代听觉工作站（ 即塔克戴维斯Techonologies）包括在一个紧凑的系统中的所有这些组件。 放置在声音衰减室中的加热垫俯卧位麻醉小鼠以避免环境噪声干扰和混响（ 图1）。 提供声刺激到外耳道。使用预设的刺激或设计适当的软件新的信号。在DA工作站输出连接到选定的扬声器。 注：FRE插入在外耳道电子领域或封闭场扬声器可以使用。前者用，因为在封闭系统中探针插入和声音调校的困难小鼠时优先考虑。自由声场扬声器刺激两只耳朵和引起双耳响应。为了得到自由声场扬声器单声道为主的反应，对侧的活动必须由闭塞（ 即带有耳塞），或者通过屏蔽噪音被消除。 放置自由场扬声器在面向头或选定耳与外耳道对准的扬声器的中心的固定距离（通常为5-20厘米）。确保没有障碍是扬声器与耳朵之间和耳廓完全打开。 放置不锈钢皮下针状电极如下：ⅰ）在两耳之间的头皮的活性（正）电极（在颅骨的顶点），ii）所述参考值（负）电极，在腮腺区域耳廓的下方，以及iii）在后面，尾部或后肢区域的接地电极（ 图1）。 检查电阻抗在正电极和负电极。确保该阻抗小于3千欧（理想1千欧）。如果是较高的，重新定位，用酒精清洁或更换电极。 对于ABR记录，从相对声压级（SPL）在5-10分贝SPL步骤27，29，30 90至10分贝降低强度产生宽带的点击和纯音频率和现在。 目前短暂点击或音爆高的水平（ 即 80或90分贝SPL）开始，降低5-10分贝SPL措施力度的刺激（1-5毫秒）。登记在刺激后的第一个10毫秒的电响应（诱发ABR响应出现在6-8毫秒）。 注：由于这个原因，刺激利率不应高于50刺激/秒（正常速率20-50）。 放大，记录和平均每个刺激和强度诱发电反应。使用具有低噪声和良好的信噪比的放大器，并将其连接到AD输入。 注：ABR上具有非常低的振幅，通常低于1μV（峰 – 峰），并且必须使用的放大器具有非常低的噪声被记录。在听力正常小鼠，清晰ABR波平均100后出现- 200的反应，但获得高品质的录音，或听力障碍的情况下，多次重复推荐（750-1,000）27。 直观地确定在测试过程中在ABR阈值。 注：ABR阈值的最低声音刺激强度上引发一个可靠的ABR浪I至IV清晰可见和中等峰-峰值电压2的SD以上的平均背景活动31的记录。这个数据得到证实杜环离线分析，与其他参数，包括峰值间潜伏期一起，和波振幅。 手动或自动地进行数据分析。 对于人工分析，确定4-5 ABR波（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ…… 等 ）和标记的峰（P1，P2，P3 …）和谷（N1，N2，N3 …）对于每一波。一旦分析完成后，将数据导出到电子表格或文本文件。 注：电反应记录的特定软件通常会自动进行分析。额外的测量可以在该ABR记录来确定响应于一个固定的强度（ 即 70或80分贝声压级），或在相对于单个点击阈值高级 （ 即 15分贝声压级超过阈值）的强度。 执行使用相应的软件ABR数据的统计分析。根据不同的实验设计，用标准的配对t检验或方差分析（ANOVA）的分析，以比较主要的ABR parameTER值在不同的组26,30。 注意：在纵向研究中，许多功能性数据被从同一动物收集在不同的时间点（ 即之前和显微之后）。在这种情况下，一般的线性模型重复测量试验提供了一个详细的方差分析。 3.车辆准备 准备和无菌条件下使用的车辆解决方案。 注：液体溶液通常是通过耳咽管迅速清除。不同注射递送系统可用于增加药物的停留时间在中耳，包括水凝胶和纳米颗粒32。 为了准备CGP-水凝胶，解散75％的脱乙酰在0.2M的醋酸产生一个1.5-2％（重量/重量），壳聚糖溶液。 9％甘油（重量/重量）加入到该溶液7。制备溶液只是给药前和储存在4°C，直到使用水凝胶。 注：CGP-水凝胶是中等粘度，但仍然在此温度下注射。低于4℃时变为固相，阻止了其应用。施用后，CGP经历在37℃在约15分钟的相变到半固体凝胶。 等分试样（0.5mL）中的商业RL缓冲器和储存在4℃直至使用。 4.显微手术操作 诱导全身麻醉用镇静剂和止痛剂的基于氯胺酮组合（ 即氯胺酮100毫克/千克，美托咪定0.05毫克/千克和phentanile 0.025毫克/公斤）通过腹膜内注射，接着吸入剂（ 即异氟烷）。 注射给药后剂，调整麻醉面罩鼠标鼻子和连接O 2供应异氟醚蒸气。维护期间的吸入麻醉显微，并监控与脚趾捏反射和呼吸模式的麻醉平面。手术开始时准备的反射是完全废除，鼠标呈现均匀的呼吸。 保持体温加热垫在整个过程中并用羟丙基甲基纤维素基于凝胶保护眼睛角膜角膜炎。 通过使用无菌单准备一个干净的手术区域。消毒显微器械与手术前玻璃珠灭菌。保持整个外科手术过程中在无菌条件（无菌手套，窗帘，手术器械等 ）。 显微 Bullostomy 注：Bullostomy是单方面的过程。操作鼠标的一只耳朵和使用对侧耳朵作为对照。 鼠标放置在一个褥疮仰卧位。在使用指甲刀到颈部腹面准备手术区除去皮毛。清洁用聚维酮碘基于消毒液的皮肤上，并用无菌窗帘覆盖。 使用手术刀，从下颌骨到锁骨做2厘米纵行切口。 根据与手术显微镜的放大倍率，确定颌下腺和钳分开两者。缩回颌下腺和定位二腹肌的起源和面神经。 使用剪刀二腹肌的起源切口，腹面收回它，露出了鼓泡的基本劣内侧面。 通过钻入其与27克的针（ 图2A）使得在泡的开口。本地化镫骨动脉和RW膜尾椎它（ 图2B）。从可吸收性明胶海绵钻孔区域清洁血液。 使用34克导管和玻璃微量注射器，缓缓注入3-5μ升通过直接bullostomy到RW利基车辆溶液（CGP-水凝胶或RL），填充它（ 图2C）。轴封采用组织粘合剂1-2滴的bullostomy。 返回颌下腺其初始位置，然后关闭皮肤切口用5-0丝线缝合手术。在一台基于洗必泰切口周围防腐剂，以避免伤口感染。注意：可以使用可吸收性和非吸收性缝线。不可吸收的缝合线，必须在2周内被移除。不推荐用于皮肤缝合丝，因为它的使用与切口感染和局部组织反应有关。 双侧鼓室注射鼠标放置在侧卧位并如4.3.1.1中所述制备外耳道下面无菌手术区。 使将0.5cm纵向切口在外耳道的靠近耳屏和s的垂直部挠度耳廓（可选）的内部皮肤褶皱。 定位在使用手术显微镜（ 图2E）的外耳道的端部的鼓膜，并确定上部鼓膜松弛部和下收杆tensa，这是由锤骨的柄分为前部和后部部分（ 图2F） 。 使在鼓膜松弛部的尾侧的小myringostomy。进行额外的切口在鼓膜的收杆tensa，以允许注射33中的空气排空。轻轻注入10-15微升车辆（CGP-水凝胶或RL）通过所述鼓膜松弛部 ，靠近RW利基直到中耳显然充分连接到34克的导管的玻璃微量注射器的解决方案。 用5-0丝线缝合手术闭合皮肤切口和清洁如4.3.1.7所述。 把鼠标放在它的另一边，OPER吃了对侧耳朵（步骤4.3.2.1至4.3.2.5）。 按住鼠标上一个加热垫，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。 监视身体状况，活性和疼痛或压力的迹象的存在。如果需要的话提供止痛剂（ 即丁丙诺啡0.05毫克/公斤，卡洛芬5-10毫克/千克）。日常检查手术伤口和皮肤去除关闭验证的伤口已经愈合后术后7-14天。 5.耳蜗细胞构筑的形态学评估安乐死鼠标在实验（在该工作28天postmicrosurgery）的端部，用腹膜内戊巴比妥过量（100毫克/千克）以研究在手术的长期影响。 执行冷0.1M的磷酸盐缓冲一个穿心灌注盐水（PBS），pH为7.5，在0.1M PBS中，随后4％（重量/体积）低聚甲醛（PFA），pH值7.5所描述的26。 注意：多聚甲醛是高毒;避免与皮肤，眼睛或粘膜接触。避免测量和准备过程中呼吸的粉末。 使用立体显微镜如所述34,35不分离前庭和内耳的耳蜗部件从颞骨解剖出来的内耳。 用4％（重量/体积）的PFA固定的分离的内耳在0.1M PBS中，pH为7.5，在4℃下轻轻摇动12小时。洗涤3×5分钟，用0.1M的PBS，pH为7.5。 脱钙用在0.1M PBS中，pH值6.5，在4℃下进行10天持续振荡制备的10％乙二胺四乙酸（EDTA）的样品，改变EDTA溶液每3天。 当耳蜗获得柔软一致性，除去EDTA和用0.1M PBS中，pH值7.5，无线洗3次5分钟日在室温下晃动。 嵌入到石蜡样品描述34并平行于蜗轴7微米厚的耳蜗部分。 为了评估耳蜗细胞结构，苏木和伊红（H＆E）染色30节和使用连接到数码相机的光学显微镜与4X和20X的镜头捕捉到的图像。 6.耳蜗基因表达清洁工作表面和手术器械用核糖核酸酶净化解决方案。 如5.1中所述，并迅速从使用显微镜的颞骨解剖出内耳安乐死鼠标。浸泡在含有核糖核酸（RNA）的保护和稳定剂的试剂的玻璃皿内耳。 删除与珠宝商镊子剩下的岩骨，轻轻耳蜗从前庭使用万纳的眼科剪35分开。 立即TRANSF呃耳蜗与80微升的RNA保护和稳定剂溶液2毫升的离心管，并通过将所述管在干冰冷冻组织。在-70℃下直到使用保存耳蜗样品。 隔离耳蜗RNA为描述35，并确定其质量和数量分光光度计。 产生从等量的总小鼠的RNA利用逆转录商业试剂盒耳蜗的cDNA。 执行定量RT-PCR一式三份扩增互补脱氧核糖核酸（基因）来衡量基因转录35,36。 注：在此工作和亲IL1B，IL6，TGFB1，肿瘤坏死因子，IL10和DUSP1抗炎基因转录进行了测量。 通过归一靶转录循环阈值（CT）的水平与参考基因水平的算术平均值和由规格化相对定量计算相对表达比问题组的转录水平的校准器组37的算术平均值。