Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.
Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם בעלי פוטנציאל אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלנית. Biofilms הפגין סובלנות גבוהה במיוחד עבור כימותרפיה, אשר נחשבה מולטיפקטוריאלית. למשל, המטריצה מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים. סביר, החוסן ביופילם נובע משילוב של אלה ואחרים, עדיין לא ידועים, מנגנונים. כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). לכן, עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר. אתגר נוסף הוא כי ישמאוד מוגבל במספר השיטות הסטנדרטיות למחקר ביופילם, במיוחד אלה שיכולים לשמש הקרנה גדולה תפוקה של ספריות כימיות. הנה, פלטפורמה אנטי biofilm ניסיון להקרנה כימית מוצגת. היא משתמשת שלושה מבחנים למדוד כדאיות ביופילם (עם מכתים resazurin), ביומסה הכולל (עם מכתים סגול קריסטל), מטריצת ביופילם (באמצעות agglutinin ניבט חיטה, מכתים WGA-קרינה מבוססת של N -acetyl-גלוקוזאמין פולי, PNAG , שבריר). כל המבחנים פותחו באמצעות Staphylococcus aureus כמו חיידקי המודל. דוגמאות לאופן שבו הפלטפורמה יכולה לשמש לסינון ראשוני וכן אפיון פונקציונלי של להיטים אנטי biofilm המזוהים מוצגות. רצף ניסיוני זה מאפשר נוסף לסיווג הלהיטים המבוססים על נקודות קצה הנמדדות. הוא גם מספק מידע על אופן הפעולה שלהם, במיוחד על לטווח ארוך בניגוד לתופעות כימותרפיות לטווח קצר. לכן, זה מאוד אדוהntageous לזיהוי המהיר של תרכובות להיט באיכות גבוהה שיכול לשמש נקודות התחלה עבור יישומים ביו שונים.
חיידקים יכולים לעבור בין שני סגנונות חיים שונים מאוד, planktonic ו נייחים, מתוכם ביופילם היא הדוגמה הנפוצה ביותר. ב biofilms, חיידקים ליצור קהילות מובנהיות משוקעות בתוך הגוש בהפקה עצמית 1. מטריקס בהפקה עצמית זו הוא חסם בין חיידקי הסביבה החיצונית שלהם, והוא מגן על תאי חיידקים, שמירה על אותם בקרבת המקום. הרכב של מטריקס ביופילם משתנה בין ואף בתוך מינים, אבל זה מורכב בעיקר רשת הדוקה של lipopolysaccharides, DNA התאי, וחלבונים. המטריצה משמשת כמחסום פיזי עיכוב הכניסה של סוכנים מזיקים, אבל זה גם מגן על ביופילם מהתייבשות ומונע הזנה לברוח התא 2.
Biofilms נחשב אחד הנושאים המאתגרים ביותר של רפואה המודרנית, והם כביכול אחראים על 80% של זיהומים אנטיביוטיים סובלני 3. הם חד פעמייםשכב סובלנות גבוהה מטבעם מפני איומים חיצוניים: לחות, לחץ האוסמוטי, לחץ מכאני 4, חום, קרינת UV 5, חומרי חיטוי, סוכני מיקרוביאלית, ומערכת החיסון של פונדקאי 1. לדוגמה, ריכוז סוכן מיקרוביאלית נדרש נדרש להרוג biofilm הוכח להיות עד 1,000 פעמים גבוה בהשוואה לזה הנדרש כדי להרוג חיידקים planktonic. הסבר סובלנות גבוהה יותר זה נראה מולטיפקטוריאלית. המטריצה מספקת מכשול פיזי מקטין את חדירת אנטיביוטיקה לתוך ביופילם. כמו כן, תאים בתוך biofilms הם phenotypically מגוונים; שהם מעבר בין מדינות שונות מטבולית בשל שיפוע הקיים של חמצן, חומרי הזנה, מטבוליטים בין החלקים הפנימיים והחיצוניים של ביופילם 6. לפיכך, באזורים מסוימים ביופילם, כגון הליבה, חיידקים ללא חמצן וחומרים מזינים חיים פעילים מבחינה מטבולית פחות או במצב רדום לחלוטין <sup> 7. התאים הרדומים לחלוטין מכונים תאי persister כמו, והם אינם רגישים 8 טיפולים קונבנציונליים מיקרוביאלית. לפיכך, סביר להניח כי החוסן ביופילם נובע משילוב של הציעו כיום ואחרים, עדיין לא ידוע, מנגנונים. Spp Staphylococcus. הם עדיין בין חיידקים גראם-חיוביים הבעייתי ביותר, גרימת 4 חמורים, לעיתים קרובות הקשורים biofilm, זיהומים. הוא הציע כי עד 99% מכלל החיידקים קשורים בתוך biofilms, מה שהופך אותו אורח חי חיידקי שולט 3. עם זאת, כל האנטיביוטיקה הקיימים כיום פותחו נגד חיידקים חד תאיים (planktonic). עד כה, רפרטואר מצומצם מאוד של מולקולות קיים שיכול לפעול באופן סלקטיבי על biofilms הבוגרת. מצב זה מונע שינוי פרדיגמה מתקדם לגילוי תרופות, שבה מחפש-biofilms אנטי כבר דחק לתפוס מקום בולט יותר.
מנקודת methodologפרספקטיבת iCal, אתגרים נוספים קיימות, כמו שרק מספר מצומצם של שיטות ביופילם פותח על ידי ארגונים תקינים, במיוחד לאלו החלימו על הקרנת התפוקה הגבוהה של ספריות כימיות. כל המבחנים הסטנדרטיים (עם רק חריג אחד) מבוססים על כורי biofilm, ושיטות אלה דורשים כמויות עבודה גדולות וכמויות גדולות של תרכובות להיבדק, אשר בדרך כלל אינן זמינים בשלב המחקר מוקדם 9-12. ההקרנה ניתן ליישמן הסטנדרטי הקיימים רק assay הוא ההתקן שנקרא קלגרי Biofilm, שממנו ריכוז ביטול biofilm מינימום הזמין המסחרי (MBEC) המערכת פותחה 13-15. עם זאת, המגבלה של assay זה היא כי biofilms גדל על יתדות, ולא כל מיני החיידקים או אפילו זנים בתוך אותו המין מסוגלים ליצור biofilms במכשיר זה. יתר על כן, שיטות שניתן ליישם במיוחד למשימות של תרכובות טבעיות הןנָחוּץ. מוצרים טבעיים היו המקור העיקרי בזכות חדשנותה בתחום גילוי תרופות מיקרוביאלית במאה השנים האחרונות 16. הם יכולים לספק תרכובות אנטי biofilm רומן עם מנגנוני פעולה ייחודיים כי גם יכול להיות יעיל נגד תאי persister. לפיכך, החקר של ספריות טבעיות ובאופן טבעי השראה שקיים הסתברות גבוהה של ייצור ידיעה אנטי biofilm מבטיחה וייחודית.
כאן, אנו מציגים את הפרטים הניסיונות של פלטפורמה של מבחנים אשר פותחה עבור ההקרנה הכימית של תרכובות אנטי biofilm באמצעות שלושה מבחנים למדוד את ההשפעות על הכדאיות, ביומסה מוחלטת, מטריצה של biofilms Staphylococcus aureus. את assay הראשון מודד כדאיות ביופילם, והיא מבוססת על מכתים resazurin. Resazurin היא כתם חיזור כי הוא כחול ללא ניאון במצב מחומצן שלה והופך ורוד, resorufin פלורסנט מאוד כאשר מופחת על ידי פעילות מטבולית של חיידקים. זהו מ 'מאוד פשוטים ומהיריםethod המתאים וניפוי ראשוני 17-20. את assay השני, המבוסס על מכתים סגול קריסטל, מודד את המסה ביופילם הכולל. סגול קריסטל הוא כתם בשימוש נרחב ללימוד חיידקים וחיידקים biofilms 19,21-23. Assay הוא מבוסס על חומרים כימיים זולים ויש לו קריאת סיום הספיג פשוטה. לבסוף, assay השלישי מתמקד חומר פולימרי תאיים (EPS) -matrix של ביופילם באמצעות נבט חיטה agglutinin (WGA), הנקשר באופן פולי N שאריות -acetyl-גלוקוזאמין (PNAG) הנוכחי במטריצה של biofilms staphylococcal 24. של WGA היא מצומדת עם fluorophore כי ניתן לאתר באמצעות קוראי עוצמת הקרינה 25. אנו מציגים כאן את הרציונל ופרטים של הפלטפורמה שפתחנו, כולל דוגמאות של יישומים.
אין שיטה אחת שניתן למדוד את ההשפעה זמנית של תרכובת על הכדאיות, ביומסה, ומטריקס ביופילם. לכן, יש צורך לשלב מבחנים כדי לזהות השפעה על שלוש נקודות הקצה, רצוי בשלב סינון ראשוני.
Resazurin הוא פרוטוקול מכתים מאוד פשוט המורכבת רק התוספת של חל…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים פרופסור פול קוס ו LMPH, אוניברסיטת אנטוורפן, בלגיה על תמיכתו בתהליך הצילומים במעבדתו. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה פרויקטים פינלנד (פרויקטי 272,266 ו 282,981) ו Svenska Tekniska Vetenskapsakademien אני פינלנד. התרומות הטכניות של MSc יאני Kujala מוכרים.
Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
Phosphate Buffered Saline | |||
Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |