해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

모든 동물 연구는 영국 홈 오피스에서 라이선스 기관의 지침에 따라 실시 하였다. 1. 해부 및 배아 마음의 고정 윤리적으로 승인 컬링 기술, 자궁 경부 전위 다음에 예를 들면, CO 2 마취를 사용하여 필요한 날에 시간 초과 – 임신 마우스를 안락사, 인산염 완충 식염수로 가득 10cm 페트리 접시에 배치, 배아 낭 (14)을 제거 (PBS) . 탯줄을 절단하고 난황을 제거, 신중하게 각각의 배아를 자궁 주머니를 열고 제거, 해부 현미경과 집게를 사용. 유전자형을 위해, 나중에 용해 / DNA 추출을위한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 배아의 꼬리와 장소를 제거합니다. 스테인레스 스틸 minutien 핀을 사용하여 PBS 채워진 실리콘 탄성 중합체 코팅 35mm 페트리 접시의 뒷면에 각각의 배아를, 마음을 제거 고정하기 위해. 미세 집게를 ca를 사용하여refully 가슴을 열고 큰 혈관을 절단, 심장에 전방. 그런 마음의 뒤에 배를 잡고 마음을 제거하고 부드럽게 당겨 집게로 마음 뒤에 도달; 폐도 동시에 얻어 올 수있다. PBS를 함유하는 신선한 35mm 페트리 접시에 중심을 전송하고, 필요한 경우, 폐 조직을 얻어 트림 미세 핀셋을 사용한다. 그런 다음 차가운 PBS로 가득 찬 48 웰 플레이트의 웰에 마음을 전송합니다. 48 웰 플레이트에있는 모든 마음을 수집 한 후, 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 PBS를 대기음 0.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 교체합니다. 주의 : PFA는, 알레르기 발암 성, 독성 것으로 알려져있다. 수정 E11.5 – 실온에서 4 % PFA에 30 분 동안 15.5 마음 – 20 분, E14.5 12.5에서 15 분 동안 마음, E13.5 마음입니다. 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 PFA를 대기음과 마음 2 배 차가운 PBS로 씻어. CAUTION : PFA는 위험합니다 및 기관 규정에 따라 폐기해야합니다. 25 % 메탄올 / 75 % PBS, 50 % 메탄올 / 50 % PBS, 75 % 메탄올 / 25 : 전체 마운트 면역 염색 즉시 사용하지 않을 경우 다음 해결책에 연속 5 분 세척을 수행하여 마음을 탈수, (섹션 2 참조) % PBS. 주의 : 메탄올은 독성, 장갑을 착용하십시오. 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 마음을 저장합니다. 안티 PECAM1 항체와 배아 마음의 2. 전체 마운트 면역 염색 참고 : 안티 PECAM1 항체가 관상 동맥 혈관을 염색 잘 작동하지만 적합 할 것 강력한 신호를 제공하는 범 내피 세포 마커 (단계 2.4 참조). 100 % 메탄올에 저장되었다 마음을 사용하는 경우, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 옮기고 다음 방법에 연속 5 분간 세척을 실시하여 재수 : 75 % 메탄올 / 25 % PBS, 50 % 메탄올 / 50 % PBS 및 25 % 메탄올 / 75 % PBS. </li> 실온에서 회전, 1.0 ml의 PBST (PBS / 0.1 % 트윈 -20) – 0.5에서 3 회 10 분 세척을 수행함으로써 마음 Permeabilize 하시려면. PBST 1.0 ml의 10 % 염소 혈청을 실온에서 1 시간 동안 회전시켜 하트 차단. 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁으로 차단 버퍼를 제거하고 400로 교체 – 1시 50분 희석 방지 PECAM1 차 항체를 포함하는 500 ㎕의 신선한 블록. 4 ℃에서 하룻밤 튜브를 돌립니다. 다음 날, 실온에서 튜브를 회전, 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫 또는 1,000 μL 피펫 팁과 블록 / 차 항체를 대기음 및 1.0 ml의 PBST 적어도 6 배 1 시간 세척을 실시하고 있습니다. 1 희석 형광 접합 된 이차 항체를 포함하는 신선한 차단 버퍼의 마지막 세척 교체 : (500), 및 회전, 4 ° C에서 밤새 품어. 호일에 튜브를 포장하여 빛으로부터 보호합니다. 다음 날, 블록 / 초를 대기음뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 ondary 항체는 실온에서 튜브를 회전, 1.0 ml의 PBST 적어도 6 배 1 시간 세척을 실시하고 있습니다. 4 °의 (빛으로부터 보호) C 필요할 때까지의 마음을 저장합니다. 용지 솔루션 및 현미경 요리 3. 준비 참고 : BABB에 마음을 이미징 할 때 BABB 솔루션 중 어느 것도 현미경의 구성 요소와 접촉 없다는 것이 매우 중요합니다. 이를 위해 다음과 같은 프로토콜은 사전에 준비 할 수 형광 현미경에 적합한 실리콘 엘라스토머 밀봉 요리를 준비하기위한 지침이 포함되어 있습니다. 실리콘 엘라스토머는 BABB을 포함하며 잠재적으로 유리 바닥 접시의 폴리 카보네이트 측간 스며드는 것을 방지하기위한 장벽을 제공한다. 직경 실리콘 엘라스토머 코팅 요리를 준비하기 위해, 나사 상단 병을 4 ml의에서 모자를 광학 유리 바닥 문화 요리를 가지고 배치 (약 1.5 cm) 각 요리의 중심입니다. 주 : 엘라스토머 접시에 적용되는 경우는 샘플이 잘 형성된다. 제조업체의 지시에 따라, 이들이 적용되는 바와 같이 두 성분을 혼합하여 도포 카트리지를 이용하여 약 0.5 cm의 깊이로 실리콘 엘라스토머를 요리 채운다. 유리 병 캡은 각 요리의 중심에 남아 있는지 확인하고, 최소 24 시간 동안 치료 둡니다. 주 : 눈을 가진 실리콘 엘라스토머의 우발적 인 접촉을 방지하기 위해 보안경을 사용하십시오. 엘라스토머의 경화 후, 각 접시의 바이알 뚜껑을 제거 이것은 샘플 접시의 바닥 유리와 직접 접촉하여 배치 될 수있는, 촬영 중앙 웰을 떠날 것이다. 참고 : 경화 때 엘라스토머 터치에 확고하고 건조해야합니다. (2 부품 벤질 벤조 에이트 1 부 벤질 알코올)을 BABB 솔루션을 준비합니다. 이 유리 병에 저장하고 빛으로부터 보호되어야한다. 주의 : BABB는 독성, 부식성 솔루션입니다. 적절한 보호 복을 착용하는 동안 흄 찬장에서 처리합니다. 유리 병에 – (5 ㎖ 1) 혼합 BABB 및 메탄올을 50:50 솔루션을 확인합니다. 호일 유리 병 포장으로, 예를 들면 빛으로부터 보호합니다. 4. 탈수, 지우기 및 공 초점 현미경에 대한 마음의 장착 참고 : 큰 샘플은 다소 작은 샘플 4 mL 유리 바이알에 클리어 할 수 (예 E13.5까지 하트)는 현미경 접시에 직접 정화 공정을 수행하는 것이 낫다. 이 방지하는 데 도움이 마음 한 번 클리어 매우 투명 해짐에 따라 샘플을 '손실'. 이 작은 샘플에 대한 청소는 몇 분 이내에 발생, 매우 빠른입니다. 참고 : / 포장 호일로 튜브와 요리를 포함하는 모든 다음 단계에서 빛으로부터 샘플을 보호합니다. 삭제하기 전에, 룸 템피에 마음을 돌려 메탄올 시리즈를 통해 면역 염색 – 마음을 탈수다음 솔루션의 연속적인 변화에 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 rature : 메탄올 / 75 % PBS, 50 % 메탄올 / 50 % PBS 75 % 메탄올 / 25 % PBS (각 5 분) 25 %. 마지막으로, 100 % 메탄올 3 × 5 분 동안 회전합니다. 최대 현미경 접시의 중앙에 E13.5, 장소의 마음에 대한; 현미경으로 심장의 지느러미 쪽 맨으로 지향되어 있는지 확인합니다. 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 심장 주위에서 모든 메탄올을 제거합니다. 깨끗한 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여, BABB를 추가 : 메탄올 50:50 솔루션을 중심 몰입하기에 충분한 볼륨 (약 300-400 μl를). 마음이 때때로 용액에 뒤집어 수 이상으로 마음은 여전히 ​​불투명 동안, 다시 방향을 확인합니다. 5 분 동안 용액에 둡니다. 흄 후드에 유리 폐기물 병에 50:50 솔루션을 제거하고 다시 뾰족한 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여, BABB로 교체합니다. 주 : 많은 양이 요구되지 않는다; suff 추가icient은되도록 마음은 용액 한 방울 내에서 앉아있다. 핵심은 5 분 이내에 취소해야합니다. 큰 하트를 들어, 유리 바이알에 샘플을 취소합니다. 주 : E15.5 마음은 30 분 – 1 시간 이내에 취소해야하지만, 필요한 경우 하룻밤 남아있을 수 있습니다. 샘플 클리어 한 후, 용액을 제거하고 BABB 최소한의 양으로 대체. 선택적으로, 그러나이 절대적으로 필요하지 않습니다, 장소에 보관하는 데 도움이, 커버 슬립과 샘플을 커버한다. 영상의 마음을 사용합니다. 공 초점 현미경 5. 이미징 해제 하트 참고 : 이미지는 10 배 또는 20 배 건조 목표를 사용하여 반전 공 초점 현미경에 포착되었다. 이 직립 촛점에 식기를 사용할 수있다하더라도, 특별한주의가 BABB 용액 목적의 접촉을 피하도록주의해야한다. 심장 (15)의 Z-검사를 수집합니다. 심장의 크기에 따라 타일 스캔 이미지 전체 심장 (16)에 요구 될 수있다. <br/>주의 : BABB는 부식성 해결책이 깨끗한 장갑을 착용하고 현미경 접시의 외부는 BABB에서 무료로 확인합니다. 주의 접시 처리하고 현미경 상 우연한 누출의 위험을 최소화하기 위해 접시에 뚜껑을 유지한다. 목적 작동 거리가 허용하는 경우, 관심 지역의 고해상도 사진을 달성하기 위해 더 높은 배율을 사용합니다. 피지 소프트웨어를 사용 6. 데이터 분석 피지 (17)의 이미지의 z 스택을 엽니 다. 전체 스택 또는 그것의 일부의 아리조나 투사하려면 이미지를 클릭 Z 프로젝트 다음 스택을 선택합니다. 시작을 입력하고 슬라이스 번호를 중지 및 z 투사, 예를 들어, 평균 강도, 최대 강도의 유형을 선택합니다. 타격 도구를 사용하여 이미지 조각의 스택 내의 개별 선박을 강조합니다 (플러그인 메뉴 선택 분할에서 다음 올가미 도구 / 불어) 및 이미지의 영역을 클릭하여 개에 가득합니다채널 조각. 선택의 전경 색상으로 선택 영역을 채우기 위해 (다음 채우기를 선택하고 편집을 클릭) 채우기 명령을 사용하여 (색상 및 전경 다음 옵션을 선택한 다음 편집을 클릭합니다). 이미지가 이전 스택 Z 프로젝트. 관상 동맥의 7 3D 표면 볼륨 렌더링 Imaris를 사용하여 생성 화면 상단에있는 능가보기 아이콘을 클릭하고 드래그하여 데이터 창에 이미지 파일을 놓습니다. 화면 상단의 3D 뷰 아이콘을 클릭합니다. 표면 아이콘 (파란색 아이콘)을 선택하고 만들기 탭을 클릭합니다. '수동으로 편집, 자동 생성 건너 뛰기'대화 상자를 클릭하고 그리기 아이콘 (얇은 연필 아이콘)을 클릭합니다. 컨투어 탭을 클릭 한 다음 모드 탭을 선택합니다. 모드에서는 마법 지팡이 또는 isoline 아이콘을 클릭합니다. '선택'을 클릭하여 다음에 화면의 오른쪽에있는 포인터 선택 포인터의 모드를 선택하고 '그리기 클릭9; (화면의 왼쪽 아래에) 상자. 연속적인 조각에 동맥의 윤곽을 선택 isoline 또는 마술 지팡이 도구를 사용합니다. 슬라이스 위치 슬라이더를 사용하여 슬라이스 조각에서 이동합니다. 모든 윤곽이 선택되었을 때, 표면을 만들기 상자를 클릭합니다. 주변 음량이 보이지 또는 블렌드 모드를 사용하여 다소 불투명 할 수있다; 강조 표시 한 다음 모드 탭 다음 설정 탭을 선택하기 위해 볼륨을 클릭합니다. 블렌드를 선택하고 불투명도를 변경하려면 슬라이더를 사용합니다. 스냅 샷 기능을 사용하여 이미지를 캡처합니다.