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Protocol
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発生生物学

Analyse des vaisseaux coronaires dans Coeurs embryonnaires Effacé

Published: December 07, 2016
doi:
10.3791/54800
, , ,
1Developmental Biology of Birth Defects,UCL Institute of Child Health, 2MRC Centre for Regenerative Medicine, SCRM Building,University of Edinburgh

概要

Nous présentons un protocole pour l'analyse des vaisseaux coronaires dans le cœur de souris embryonnaires entières jusqu'à E15.5, en utilisant des méthodes de coloration immunologique standard suivie d'un dégagement optique et microscopie confocale. Cette technique permet la visualisation des vaisseaux sanguins dans l'ensemble du coeur sans le besoin d'une analyse de temps de coupes en série.

Abstract

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

Introduction

L'établissement d'un réseau coronaire fonctionnement est crucial pour la fonction cardiaque et le développement embryonnaire, et l'analyse des mutants de souris génétiques peuvent fournir des informations précieuses sur les signaux moléculaires qui sous-tendent ce processus de développement. La capacité à visualiser le plexus coronaires embryonnaires dans son ensemble, plutôt que présenté dans une série de coupes histologiques, est essentielle pour faciliter l'analyse des motifs des navires dans des mutants génétiques, et évite la perte potentielle d'informations qui peuvent survenir à la suite de la mécanique le découpage du tissu. Les navires Fated pour former les artères et capillaires sont localisés profondément dans les parois des deux ventricules et l'aorte 1-3. Toutefois, alors que le marquage fluorescent des cellules associées à laser , microscopie confocale à balayage peut fournir des images de haute résolution des vaisseaux lymphatiques superficiels veineux / 4,5 wholemount marqué, la profondeur de l' imagerie est limité par la pénétration optique. Imagerie à haute résolution du bouchonillaries et les artères à travers toute la profondeur du cœur est donc pas possible sans une certaine forme de compensation de tissu.

La pénétration optique pauvre est causée par l'indice de réfraction élevé du multiple cellulaire et extracellulaire composants des tissus épais (par exemple, le collagène et les fibres élastiques). Ce diffuse la lumière d'imagerie, ce qui provoque le flou et une diminution de contraste. agents de compensation correspondent généralement l'indice de réfraction élevé de ces tissus, ce qui signifie que la lumière peut voyager à travers l'échantillon dégagée et pénétrer plus profondément dans le tissu. Avant de compensation, les tissus sont généralement déshydratés que l'eau est relativement faible indice de réfraction. Une pléthore de nouvelles méthodes de compensation ont été développés récemment, toutefois en fonction de la technique utilisée, le processus de compensation peut prendre des jours ou des semaines et peut nécessiter des réactifs coûteux 6-9. BABB (1: 2 du mélange d'alcool benzylique et de benzoate de benzyle) est un agent de compensation utilisée bon marché, ce qui aavantage de préparer des échantillons très rapidement. Les techniques de compensation et d' imagerie à base BABB ont été décrits précédemment pour les échantillons neurologiques et des divers organes de 10-13. Nous décrivons ici une technique robuste et simple pour le jeu BABB d'échantillons immunocolorées suivie par microscopie confocale, avec une référence spécifique à l'examen des vaisseaux sanguins dans les coeurs murins de E (jour embryonnaire) de 11,5 à 15,5. Cependant, comme cela a été démontré, la technique peut aussi bien être appliquée à l'analyse des embryons entiers, ainsi que d'autres types de cellules, tant des anticorps de qualité élevée pour les marqueurs d'intérêt sont disponibles.

Protocol

Toutes les recherches sur les animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles sous licence du Home Office du Royaume-Uni. 1. Dissection et fixation des coeurs embryonnaires Euthanasier une souris temporisée enceinte le jour requis en utilisant une technique abattage éthique approuvé, par exemple, CO 2 narcose suivie par dislocation cervicale, et enlever les sacs embryonnaires 14, les plaçant dans une boîte de Pétri 10 cm rempli de tampon phosphate salin (PBS) . En utilisant un microscope à dissection et une pince, ouvrir soigneusement les sacs utérines et enlever chaque embryon, couper le cordon ombilical et le retrait du sac vitellin. Aux fins de génotypage, retirer la queue embryonnaire et place dans un tube de 1,5 ml pour l'extraction de lyse / ADN plus tard. Afin de retirer le coeur, épingler chaque embryon sur son dos dans un élastomère de silicone revêtu 35 mm boîte de Pétri PBS rempli, en utilisant des broches en acier inoxydable minuties. En utilisant des pinces fines, carefully ouvrir la poitrine et couper les gros vaisseaux, antérieure au cœur. atteignant ensuite derrière le cœur avec la pince, saisir les vaisseaux derrière le cœur et tirer doucement pour enlever le coeur; les poumons peuvent aussi se détacher en même temps. Transférer le cœur à une boîte de 35 mm frais de Pétri contenant du PBS et utiliser une pince fine à rogner le tissu pulmonaire, si nécessaire. Puis transférer le coeur à un puits d'une plaque de 48 puits rempli avec du PBS froid. Après avoir recueilli tous les cœurs dans la plaque de 48 puits, aspirer le PBS avec une pipette Pasteur en plastique à pointe fine et le remplacer par 0,5 ml de 4% paraformaldéhyde (PFA). ATTENTION: PFA est un connu pour être allergéniques, cancérigènes et toxiques. Fix E11.5 – 12,5 coeurs pour 15 min, coeurs E13.5 pour 20 min et E14.5 – 15.5 coeurs pour 30 min, dans 4% PFA à la température ambiante. Aspirer le PFA avec une pipette Pasteur en plastique à pointe fine et rincer les coeurs 2x dans du PBS froid. ACPPUION: PFA est dangereux et doit être éliminé conformément à la réglementation institutionnelle. Si ne pas utiliser immédiatement pour toute immunocoloration de montage (voir la section 2), déshydrater les coeurs en effectuant lavages successifs 5 min dans les solutions suivantes: 25% de méthanol / 75% de PBS, 50% de méthanol / 50% de PBS, 75% de méthanol / 25 % de PBS. ATTENTION: Le méthanol est toxique, porter des gants. Conserver les coeurs à -20 ° C dans 100% de méthanol. 2. Tout le mont immunocoloration des coeurs embryonnaires avec Anti-PECAM1 Anticorps NOTE: Les anticorps anti-PECAM1 fonctionnent bien pour la coloration des vaisseaux coronaires (voir étape 2.4), mais tout marqueur pan-endothélial qui donne un signal fort serait approprié. Si l'on utilise des cœurs qui ont été stockées dans 100% de methanol, transférer 1,5 ml microtubes et réhydrater en effectuant des lavages successifs de 5 min dans les solutions suivantes: 75% de méthanol / 25% de PBS, 50% de méthanol / 50% de PBS et 25% méthanol / 75% de PBS. </li> Perméabiliser les coeurs en effectuant 3 x 10 min lavages dans 0,5 à 1,0 ml de PBST (PBS / 0,1% Tween-20), tourne à la température ambiante. Bloquer les coeurs en faisant tourner pendant 1 heure à température ambiante dans 1,0 ml 10% de sérum de chèvre dans le PBST. Retirez un tampon de blocage avec une pipette Pasteur en plastique à pointe fine ou 1000 pi pointe de la pipette et le remplacer par 400 – 500 pi bloc frais contenant l'anticorps primaire anti-PECAM1 dilué 1:50. Faites tourner les tubes pendant une nuit à 4 ° C. Le lendemain, aspirer l'anticorps de bloc / primaire avec un plastique pipette Pasteur à pointe fine ou 1000 pointe de la pipette ul et effectuer au moins 6x 1 h lavages dans 1,0 ml de PBST, faire tourner les tubes à la température ambiante. Remplacer le dernier lavage avec du tampon de blocage frais contenant l'anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dilué à 1: 500, et incuber pendant une nuit à 4 ° C avec rotation. Protéger de la lumière en enveloppant les tubes en aluminium. Le lendemain, aspirez le bloc / secanticorps secon- avec une pipette Pasteur en plastique à pointe fine et effectuer au moins 6x 1 h lavages dans 1,0 ml de PBST, faire tourner les tubes à la température ambiante. Conserver les coeurs à 4 ° C (protégé de la lumière) jusqu'à ce que nécessaire. 3. Préparation des solutions de compensation et plats Microscopie REMARQUE: Lorsque l'imagerie coeurs en BABB il est vital que rien de la solution BABB entre en contact avec les composants du microscope. A cet effet, le protocole suivant contient des instructions pour la préparation des plats en élastomère silicone étanche convenant à la microscopie par fluorescence, qui peuvent être bien préparés à l'avance. L'élastomère de silicone constitue une barrière pour contenir les BABB et l'empêcher de suinter entre le potentiel de fond en verre et les parois de polycarbonate de la coupelle. Pour préparer les plats enduits d'élastomère silicone, prennent des boîtes de culture à fond de verre optique et de placer un bouchon à partir d'un 4 ml vis supérieure flacon (environ 1,5 cm de diamètre) Dans le centre de chaque plat. NOTE: Cela formera un puits pour l'échantillon lorsque l'élastomère est appliqué sur le plat. Remplir les boîtes d'élastomère de silicone à une profondeur d'environ 0,5 cm, à l'aide d'une cartouche d'applicateur pour mélanger les deux composants tels qu'ils sont appliqués selon les instructions du fabricant. Laisser durcir pendant au moins 24 heures, en veillant à ce que le bouchon du flacon reste au centre de chaque plat. REMARQUE: Utiliser des lunettes de sécurité pour éviter tout contact accidentel de l'élastomère de silicone avec les yeux. Après le durcissement de l'élastomère, retirez le bouchon du flacon de chaque plat, Cela laissera un puits central où l'échantillon à imager peut être mis en contact direct avec le fond de verre du plat. REMARQUE: une fois durci l'élastomère doit être ferme et sec au toucher. Préparer la solution BABB (1 partie d'alcool benzylique à 2 parties benzoate de benzyle). Ceci doit être stocké dans une bouteille en verre et protégé de la lumière. ATTENTION: BABB est une solution corrosive toxique. Manipuler dans une hotte tout en portant des vêtements de protection appropriés. Mélange BABB et de methanol pour obtenir une solution 50:50 (1 – 5 ml) dans un flacon en verre. Protéger de la lumière, par exemple, en enveloppant le flacon dans une feuille. 4. Déshydratation, la compensation et le montage des coeurs pour la microscopie confocale NOTE: Agrandir les échantillons peuvent être effacées en 4 flacons ml en verre, mais pour de petits échantillons (par exemple, les cœurs jusqu'à E13.5) , il est préférable d'effectuer le processus de compensation directement dans le plat de la microscopie. Cela permet d'éviter «perdre» les échantillons que les coeurs deviennent très transparent une fois effacé. Pour ces petits échantillons de compensation est très rapide, se produisant en quelques minutes. REMARQUE: Protéger les échantillons provenant de la lumière au cours de toutes les étapes suivantes en enroulant / revêtement de tubes et plats avec du papier. Avant d'effacer, déshydrater les-coeurs immunocolorées à travers une série de méthanol en faisant tourner les coeurs à la salle tempehrature dans un tube de 1,5 ml à des changements successifs des solutions suivantes: 25% de méthanol / 75% de PBS, 50% de méthanol / 50% de PBS et 75% de méthanol / 25% de PBS (5 minutes à chaque fois). Enfin, tourner pendant 3 x 5 min à 100% de méthanol. Pour les cœurs jusqu'à E13.5, dans le centre du plat de microscopie; sous le microscope assurer le cœur est orienté avec son plus haut de la face dorsale. Retirez tout le méthanol à travers le cœur avec une pipette à pointe fine en plastique Pasteur. L'utilisation d'un plastique propre pipette Pasteur en pointe fine, ajouter BABB: méthanol 50:50 solution dans un volume suffisant pour immerger le coeur (environ 300 – 400 pi). Comme les coeurs peuvent parfois retourner plus dans la solution, vérifier à nouveau l'orientation alors que les cœurs sont encore opaque. Laisser reposer la solution pendant 5 min. Retirer la solution 50:50 à une bouteille de déchets de verre dans la hotte et le remplacer par BABB, de nouveau en utilisant une matière plastique Pasteur pipette à pointe fine. NOTE: Un grand volume est pas nécessaire; ajoutez suffisant pour que le cœur se trouve dans une goutte de solution. Le cœur devrait disparaître en moins de 5 min. Pour les plus grands cœurs, effacer les échantillons dans des flacons en verre. NOTE: Un coeur de E15.5 devrait disparaître en moins de 30 min-1 heure, mais peut être laissé durant la nuit si nécessaire. Après que l'échantillon est clair, retirer la solution et le remplacer par un volume minimal de BABB. En option, couvrir l'échantillon avec une lamelle, pour aider à le maintenir en place, mais ce ne sont pas absolument nécessaires. Utilisez le cœur pour l'imagerie. 5. Imagerie Effacé Hearts par microscopie confocale NOTE: Les images ont été capturées sur un microscope confocal inversé en utilisant 10X ou 20X objectifs secs. Bien qu'il soit possible d'utiliser les plats sur un confocal debout, des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter le contact de l'objectif avec la solution BABB. Prélever un z-scan du cœur 15. En fonction de la taille du cœur, un balayage de tuiles peut être nécessaire à l' image de tout son cœur 16. <br/> ATTENTION: BABB est une solution corrosive, porter des gants propres et assurer l'extérieur du plat de la microscopie est exempt de BABB. Manipuler le plat avec soin et garder le couvercle sur le plat pour minimiser le risque de déversement accidentel sur le microscope. Si la distance de travail objectif permet, utiliser un grossissement plus élevé pour atteindre des images haute résolution de régions d'intérêt. 6. Analyse des données Utilisation de Fidji Software Ouvrez le z pile d'images à Fidji 17. Pour la projection az de l'ensemble de la pile ou une partie de celui-ci, cliquez sur l'image et sélectionnez Stack, suivi de projet Z. Entrez le démarrage et d' arrêt des numéros de tranche, et sélectionnez le type de z projection, par exemple, l' intensité moyenne, l' intensité max. Pour mettre en évidence les navires individuels dans une pile de tranches d'images utilisent l'outil de Blow (dans le menu Plugins sélectionnez Segmentation, puis Soufflez / outil Lasso) et cliquez sur les zones de l'image à remplir eatranche ch. Utilisez la commande de remplissage (cliquez sur Modifier, puis sélectionnez Fill) pour remplir les zones sélectionnées avec la couleur de premier plan de choix (cliquez sur Modifier, puis sélectionnez Options, suivis par les couleurs et de premier plan). Z projeter l'image pile comme avant. 7. 3D Volume de surface Rendu des artères coronaires générées en utilisant Imaris Cliquez sur l'icône Vue Surpass en haut de l'écran et faites glisser et déposez le fichier d'image dans la fenêtre de données. Cliquez sur l'icône Vue 3D en haut de l'écran. Sélectionnez l'icône surfaces (icône bleue), puis cliquez sur l'onglet Créer. Cliquez sur la boîte de dialogue "Passer la création automatique, modifier manuellement» et cliquez sur l'icône de dessin (mince crayon icône). Sélectionnez l'onglet Contour, puis l'onglet Mode. En mode, cliquez sur la baguette magique ou icônes isolignes. Choisissez le mode de pointeur dans la sélection du pointeur sur le côté droit de l'écran en cliquant à côté de 'Select', puis cliquez sur le 'Draw9; boîte (dans le coin inférieur gauche de l'écran). Utilisez le isoline ou outil de baguette magique pour sélectionner les contours des artères en tranches successives. Naviguez de tranche à découper à l'aide du curseur Slice Position. Lorsque tous les contours ont été sélectionnés, cliquez sur la case Créer Surface. Le volume environnant peut être rendu invisible, ou rendu plus ou moins opaque en utilisant le mode de fusion; cliquez sur le volume pour le mettre en surbrillance, puis sélectionnez l'onglet Paramètres, puis sur l'onglet Mode. Sélectionnez Blend et utilisez le curseur pour modifier l'opacité. Capture d'images en utilisant la fonction Snapshot.

Representative Results

Comme le cœur se développe, le myocarde ventriculaire est envahi par les cellules endothéliales (CEs) provenant de diverses sources, et un plexus vasculaire est formée. Les navires qui se développent dans le myocarde ventriculaire iront à former les réseaux capillaires et artérielles délivrant le sang oxygéné vers le tissu cardiaque 18. Dans le même temps (environ E11.5) des tiges coronaires commencent à se développer indépendamment d'un réseau capillaire séparé (connu sous le plexus peritruncal) qui entoure la lumière de l'aorte 14,19,20. Plexus Peritruncal CEs forment initialement des connexions multiples avec la lumière de l'aorte au niveau des sinus de soupape, mais en fin de compte qu'un seul navire persistera sur chaque côté de l'aorte, en continuant de former les racines des artères coronaires gauche et droite 21. D'environ E13.5 la peritruncal ventriculaire et les vaisseaux du myocarde se rejoignent pour former un réseau interconnecté, permettant le flux sanguin à partir de l'unorta dans les vaisseaux coronaires 14,22. Coloration des CEs anti-PECAM-1 anticorps, combinée avec un jeu BABB des coeurs intacts, permet l'analyse des réseaux coronaires en développement dès les premiers stades possibles. À des stades de développement plus tard, la structuration des artères coronaires de maturation peut également être examinée. Ce procédé peut également être utilisé pour colorer le système vasculaire d'embryons entiers (jusqu'à au moins E11.5) et avec des anticorps différents, par exemple, l' anti-alpha- actine de muscle lisse (Sm22α) et Endomucin. La figure 1 montre l' intensité z-projections maximales d'un cœur de E11.5 généré en utilisant un logiciel Fidji. La fonction Tile a été utilisé pour recueillir des multiples images partielles du cœur et de les assembler en une image complète; ce qui est utile pour donner un aperçu de la coloration dans l'ensemble de l'échantillon. A cet anticorps PECAM1 stade taches principalement la doublure endocarde du coeur et de sortie vessels, mais un peu CEs peut également être observé dans la paroi du ventricule gauche (région encadrée de la figure 1A, représentée agrandie sur la 1A '). En outre, le plexus peritruncal peut être clairement observé dans la paroi du tube de sortie (OT) (région encadrée de la figure 1B). Dans ce dernier cas, ce qui réduit le nombre de tranches dans l'empilement z utilisé pour générer la projection a amélioré la netteté de l'image, ce qui permet les connexions avec la lumière de l'aorte à visualiser plus nettement (figure 1B). Sur la figure 2, le système vasculaire accrue proximale par rapport à l'aorte peut être observée dans un coeur E12.5. La figure 3 montre le plexus peritruncal dans un coeur de E12.5. 12 la tranche z projection sur la figure 3A montre l'ensemble du plexus, cependant que certains bateaux sont localisés ventralement à la lumière de l'aorte (qui est également fortement colorée par l' anticorps anti PECAM1), le fractionnement de la pile z into un certain nombre de sous-empilages (figure 3B-D) permet d' obtenir plus d' informations visuelles. Par exemple, la sous-empilement projeté sur la figure 3B montre un récipient peritruncal de liaison à la surface ventrale de la lumière aortique, qui ne sont pas visibles dans la projection complète. La figure 4 montre une partie d'un coeur de E15.5; les artères coronaires sont clairement visibles à ce stade (figure 4A, la projection 30-slice). Dans les 5 tranches z saillies représentées sur les figures 4B et C , les valves aortique et pulmonaire peuvent également être visualisés par coloration PECAM1; les branches et les interconnexions du réseau capillaire coronaire sont également plus clair dans ces projections sous-pile plus petits. Techniques de segmentation manuelles ont été utilisées pour mettre en évidence les artères coronaires à l' aide de Fidji (Figure 4D) ou Imaris (Figure 4D et E). Le rendu de volume de surface 3D des artères coronaires / lumière aortique u généréessing Imaris peut être visualisé avec ou sans la vascularisation environnante (Figure 4E et F). La vascularisation des embryons entiers peut également être examiné en utilisant PECAM1 coloration / BABB jeu. Figure 4A et A ', montrent z projections générées à partir de sous-piles du côté droit (z tranches 11 – 65) et côté gauche (z tranches 66-110) de l'embryon , respectivement. La comparaison des deux images montre que l'intensité du signal fluorescent n'a pas diminué de façon significative avec une pénétration plus profonde dans le tissu. Sur la figure 4B, PECAM1 (rouge signal) et Endomucin (signal vert) des anticorps ont été combinés pour étiqueter les artères intersomitiques (ISA) et les veines , respectivement, d'un embryon de E11.5. Figure 4C montre SM22α (signal rouge) et PECAM1 coloration (signal vert) des normes ISA dans un embryon E11.5. La figure 6, les embryons E11.5tachée de PECAM 1 ont été imagées immédiatement après la clairance BABB (figure 4A), ou après un intervalle d'environ deux mois (figure 4B). Le signal fluorescent était encore assez fort pour l'image avec succès après un stockage prolongé de l'échantillon dans BABB. Figure 1. immunocoloration d'un coeur E11.5 avec Anti-PECAM1 Anticorps (détecté avec Anti-rat IgG Conjugué à Alexa 594). (A, B) une image 2 x 2 carrelée a été recueillie à l' aide de l'objectif 10X d'un microscope confocal inversé. PECAM1 taches d'anticorps à la fois endocardiques et vasculaire CEs. Projections (intensité maximale) ont été générés à partir de 22 (A) ou 5 (B) z tranches chacune de 4 um d'épaisseur, en utilisant le logiciel Fidji. A 'et B' sont enlargements des zones encadrées en A et B respectivement. Les flèches en A 'indiquent les vaisseaux sanguins dans la paroi du ventricule; en B ', le support indique le plexus peritruncal. OT, sortie des voies; LV, ventricule gauche, RV ventricule droit. Toutes les images sont des vues frontales. Barres d'échelle en A et B = 200 pm; barres d'échelle en A 'et B' = 100 um. Panel 1B 'a été adapté de Ivins et al., 2015 19. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. immunocoloration d'un E12.5 Coeur avec Anti-PECAM1 anticorps. Le panneau A montre la projection az (intensité maximale) d'un balayage de 2×2 carrelée. La région encadrée en A est représenté enlarged dans A '; les flèches indiquent les multiples vaisseaux sanguins dans l'aorte proximale (Ao). LV, ventricule gauche, RV ventricule droit. Toutes les images sont des vues frontales. Barre d'échelle en A = 200 um; barre d'échelle en A '= 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. L' imagerie du Peritruncal Plexus dans un coeur E12.5. Les images confocales d'une aorte E12.5 (Ao) colorées avec un anticorps anti-PECAM1 ont été recueillies en utilisant l'objectif 10X. La z projection (intensité maximale) en A a été généré à partir de 12 tranches z (4 um d'épaisseur); flèches indiquent les vaisseaux du plexus peritruncal. BD Les 12 z tranches ont été divisés en trois sous-piles comme indiqué et utilisé pour générer projecti séparéeons; les pointes de flèche indiquent les connexions formées par le plexus peritruncal à la lumière de l'aorte. Les navires Peritruncal localisés ventralement à la lumière de l'aorte sont visibles dans B et C. Toutes les images sont des vues frontales. Barre d'échelle = 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. artères coronaires et Capillaire Plexus dans un coeur E15.5. images confocale d'un cœur de E15.5 colorées avec un anticorps anti-PECAM1 ont été recueillies à l'aide de l'objectif 10X. Le panneau A montre une intensité z projection maximale générée à partir de 30 tranches z (4 um d'épaisseur); les flèches indiquent les artères coronaires gauche et droite (LCA RCA) et que l'on voit la connexion à l'aorte (Ao). Utilisation de différent 5 z tranche sous-empile les valves aortiques et pulmonaires (AOV et PV) peut être vu dans B et C respectivement (crochets bleus). Le plexus capillaire ventriculaire est également plus clair dans ces projections sous-pile plus petits; les vaisseaux sanguins proximales à la (petite boîte) de la valve pulmonaire sont présentés élargie en bas à droite du panneau C (grande boîte). Fidji a été utilisé pour mettre en évidence des vaisseaux sanguins individuels, par exemple, pour le panneau D Blow / outil Lasso a été utilisé pour combler les artères coronaires par la couleur rouge manuellement dans chaque z tranche avant projection. Logiciel Imaris a été utilisé pour créer des images 3D des artères (rouge) et lumière aortique (vert) dans E et F; encore une fois cela a été fait manuellement, en utilisant l'outil de baguette magique pour créer des contours d'objets dans chaque z tranche. L'opacité du volume environnant peut être modifié en mode Blend, comme dans E. En variante, l'image 3D peut être extrait, comme le montre F </strong>. LV, le ventricule gauche. Toutes les images sont des vues frontales. Barre d'échelle en A = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. Imagerie Embryonnaire vascularisation. Les panneaux A et A 'montrent des images confocale d'un E10.5 sauvage de type embryon colorées avec un anticorps anti-PECAM1, recueillies à l' aide de l'objectif 10X (balayage en mosaïque). Intensité moyenne z projections ont été générées à partir z tranches 11-65 (A) et 66-110 (A ') d'une analyse de tranche de 120 z (4 um tranches épaisses), montrant seulement une légère perte d'intensité de fluorescence à travers l'épaisseur de l'embryon . Le panneau B montre les vaisseaux intersomitiques d'un embryon de E11.5 colorées avec Antibod s contre PECAM1 (signal rouge d'anticorps secondaire 594-conjugué) et Endomucin (EMCN, signal vert de l'anticorps secondaire 488-conjugué), qui colorent les artères intersomitiques (flèche) et les veines (flèche), respectivement (intensité moyenne z projection à partir d'une mosaïque balayage). Le panneau C montre artères intersomitiques (ISA) à partir d' un E11.5 sauvage de type embryon colorées avec des anticorps contre PECAM1 (de signal vert de l' anticorps secondaire 488-conjugué) et SM22α (signal rouge d'anticorps secondaire 594-conjugué). Les images confocales ont été recueillies à l'aide de l'objectif à sec 20X et utilisés pour générer un maximum d'intensité z projections. Toutes les images sont vues sagittale. Les barres d'échelle en A et B = 250 um, bar à grande échelle dans C = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. d / 54800 / 54800fig6.jpg "/> Figure 6. Les échantillons immunocolorée Effacé dans BABB Retain Fluorescent signal pour au moins deux mois. embryons E11.5 ont été colorées avec un anticorps PECAM1 et apurés avec BABB; embryons issus du même lot ont été imagées immédiatement ou après un intervalle de deux mois. Le panneau A montre les artères intersomitiques de l'embryon imagées immédiatement et le panneau B montre l'embryon imagé deux mois plus tard. Les images confocales ont été recueillies à l'aide de l'objectif à sec 10X et utilisés pour générer un maximum d'intensité z projections. dAO, de l'aorte dorsale. Images montrent des vues sagittales. Les barres d'échelle en A et B = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

les vaisseaux coronaires dans le cœur embryonnaire entiers ont été imagées par immunocoloration avec un anticorps anti wholemount-PECAM1 suivie d'une clairance optique et microscopie confocale. La méthode simple décrite ici, pour le jeu de coeurs de souris embryonnaires avec BABB, augmente la pénétration optique et permet la capture d'images à haute résolution des vaisseaux sanguins localisés dans l'aorte et ventriculaires murs. Des réactifs de montage à base de glycérol tels que Vectashield (indice de réfraction 1,45) ont également été utilisés pour l' imagerie du système vasculaire coronaire 22 mais l'indice de réfraction plus élevé de BABB (1,56) réduit la diffusion de lumière encore, ce qui permet la pénétration des tissus plus profonds. clairance tissulaire élimine le besoin pour des formes coûteuses plus complexes de la microscopie tels que multiphotonique et la microscopie nappe de lumière qui peut être moins facilement accessibles aux chercheurs. Le processus de compensation est extrêmement rapide par rapport à d' autres méthodes 6-9 et pour les petits échantillons peuvent être carried à l'aide de petits volumes de réactifs directement sur le plat de la microscopie. la coloration du système vasculaire robuste est nécessaire afin d'obtenir des images de haute qualité; anticorps anti-PECAM1 a été choisie car elle marque tous les types de CEs coronaire et un certain nombre d'anticorps commerciaux ont été trouvés pour donner des niveaux convenablement élevés de coloration. En outre, la coloration fluorescente semble être extrêmement stable dans BABB; échantillons stockés à température ambiante dans BABB (abri de la lumière) ont conservé leur signal fluorescent pendant plusieurs mois. Le fait que les anticorps PECAM1 étiquettes de manière efficace l'endocarde coronaire, ainsi que le système vasculaire était parfois problématique, en particulier lors de la capture d'images du plexus peritruncal. Forte coloration de la lumière de l'aorte par rapport à la CEs peritruncal a donné lieu à un risque de sursaturation dans certaines zones des images, ce qui signifie un ajustement soigneux des paramètres de formation d'image est nécessaire. Idéalement, une coloration d'anticorps seulement vasculaire CEs serait utilisé; en pratique,cependant trouver des anticorps appropriés qui donnent le niveau requis de coloration wholemount peut être difficile. Récemment, la protéine de liaison aux acides gras 4 (FABP4) a été montré pour être un marqueur de coronaire vasculaire CEs 23 et peut donc représenter une alternative à PECAM1.

Afin de conserver la morphologie 3D de l'aorte et le cœur des chambres les échantillons ne sont pas montées à plat, mais ont plutôt été imagé dans les plats à fond de verre. La profondeur des échantillons à imager interdit l'utilisation d'objectifs à fort grossissement, en raison de leurs distances de travail de courte durée. Cependant les images à haute résolution sont encore réalisables en utilisant un objectif 10X en augmentant le temps de séjour de pixels et en utilisant une taille de matrice de pixels d'au moins 1,024 x 1,024 pour la capture d'image. Cela a été suffisant pour l'analyse de la structure et la distribution des vaisseaux coronaires, cependant une analyse plus fine de la structure cellulaire peut nécessiter un montage à plat d'échantillons. Dissection des différentes parties du coeur pour le montage,par exemple, les parois du ventricule ou de l' aorte, peuvent également être nécessaires. En variante, la sur-échantillonnage de l'image, suivie par déconvolution peut être effectuée afin d'augmenter la résolution et la sensibilité; cela nécessite cependant beaucoup plus de fois la numérisation et crée de très grands fichiers d'images qui nécessitent beaucoup de puissance pour traiter le calcul.

Coeurs jusqu'à E15.5 ont été imagées en utilisant cette méthode avec succès, et il est également possible d'analyser le système vasculaire d'embryons entiers (jusqu'à au moins E11.5) en utilisant le même protocole. D' autres types de cellules, par exemple, des cellules musculaires lisses ont été imagées dans notre laboratoire en utilisant cette technique. Pour les tissus plus épais, par exemple, des cœurs de plus de E15.5, la pénétration de l' anticorps peut être un facteur limitant; incubations plus longues et / ou une augmentation de détergent peuvent être nécessaires. En outre, lors de la collecte d'une grande z pile d'images force du signal peut être réduite que les lasers pénètrent dans les parties les plus éloignées de tissu; cependant, la confparamètres vecinales peuvent être ajustées pour augmenter la puissance du laser avec l'augmentation de la distance z.

Cette méthode facilite l'analyse microscopique confocale des deux premières étapes de la formation des vaisseaux coronaires et de la structuration des artères coronaires à des stades de développement ultérieurs. Des informations détaillées sur la distribution, la ramification et la structure des vaisseaux sanguins peut être acquis en peu de temps, ce qui en fait un outil précieux pour l'étude des mutants de souris génétiques avec des défauts spécifiques dans les voies de l'angiogenèse.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travail a été financé par le Cœur Foundation'and britannique soutenu par l'Institut national pour le Centre de recherche biomédicale de recherche en santé au Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust et University College London.

Materials

PBS Life Technologies 14190-094
Forceps FST 11251-30
10cm Petri dishes Falcon 351029
35mm Petri dishes Sigma P5112
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter FST 26002-20
Fine tip pastettes  Alpha Laboratories LW4061
1000ml pipette tips Sorenson 34000
48-well plate Falcon 353078
Kwik-Gard World Precision Instrument KWIKGARD Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing
Kwik-Gard refill World Precision Instrument KWIKGLUE Refill cartridges and dispensing tips
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in PBS and store at -20°C
100% methanol VWR 20847307
Tween®20 Sigma P1379
Goat serum Sigma G9023
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse BD Pharmingen 553370 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal Abcam ab28364 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal Thermo Fisher Scientific MA3105 Primary antibody, dilute 1 in 400
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal Santa Cruz Biotechnology sc-65495 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal Abcam ab14106 Primary antibody, dilute 1 in 250
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A11007 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Abcam ab173003
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21208 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Phenolic screw cap Wheaton 240408
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma B6630
Imaris Bitplane Imaging image analysis software
Image J software NIH Freeware
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参考文献

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Ivins, S., Roberts, C., Vernay, B., Scambler, P. J. Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts. J. Vis. Exp. (118), e54800, doi:10.3791/54800 (2016).
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