Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC) Bristol Southmead Hastanesi Araştırma Etik Kurulu kurallarına tam uygun (referans # 078/01) ve hasta onam alındıktan sonra total kalça protezi ameliyatı geçiren osteoartritik hastalarda proksimal femur kemik iliğinden hasat edildi. 1. Magnetoferritin sentezi ve saflaştırılması Genel açıklamalar metal ön oksidasyonunu kısıtlamak için nitrojen atmosferi altında 65 ° C sıcaklıkta bir yapışmalı, çift ceketli bir reaksiyon kabı içinde magnetoferritin sentezlenmesinde. Bir şırınga pompası kullanılarak tepkime kabına kapak erişim portu üzerinden metal tuz çözeltileri ve hidrojen peroksit enjekte edilir. magnetoferritin Sentezden sonra, anyon değişim kromatografisi ile proteinin saflaştırmak boyut dışlamalı kromatografi, ardından Protein boşluğu içine alınmış nano-tanecikleri uzaklaştırmak için (bakınız bölüm 1.4), protein monomerleri izole edilmesi için (Bölüm 1.5 bakınız). deBir Bradford tahlili kullanılarak termine protein konsantrasyonu (bölüm 1.6 bakınız). Hazırlık sentez öncesinde Su içinde bir azot gazı silindirine bağlanmış bulunan bir tüp yerleştirmek streç film ile bir kanalın kilitleme ve yaklaşık 60 dakika boyunca nitrojen gazı geçirilerek, iyonsuzlaştırılmış suyun 500 ml oksilenlendirilmesi. 65 ° C çift cidarlı reaksiyon kabına bağlı bir su banyosu ısıtın. yaklaşık 20 dakika boyunca bir tampon çözeltisi ile azot gazı geçirilmesi yolu ile kap ve oksilenlendirilmesi mühür, tepkime kabına, 50 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu (pH 8.6) 75 ml ilave edilir. Aynı zamanda, manyetik bir karıştırıcı kullanarak tampon çözeltisi ilave edin. HEPES tampon çözeltisi oksijen alma sonra tampon azot gazı tedarik tüpü çıkar ve bu, bir nitrojen atmosferi korumak için kap içerisinde süspanse edin. 3 mg / m bir nihai konsantrasyon elde etmek için, apo-ferritin eklemel. Manyetik karıştırmaya devam edin, ancak köpürme meydana gelirse karıştırma hızını azaltmak. deoksijene deiyonize su, 50 ml 0.19 g çözülerek kobalt sülfat heptahidrat bir 25 mM stok çözelti hazırlayın. deoksijene deiyonize su, 100 ml 0.98 g çözülerek amonyum demir sülfat hekzahidrat solüsyonu 25 mM çözelti hazırlayın. amonyum demir sülfat hekzahidrat solüsyonu 2.5 ml alın ve kobalt sülfat heptahidrat 2.5 ml ile değiştirin. İlk deoksijene deiyonize su 9 ml (ağ / ağ% 30), bir hidrojen peroksit çözeltisi 965 ul ekleyerek ve daha sonra 99 ml için bu alt stokunun 1 ml ekleyerek deoksijene deiyonize su içinde hidrojen peroksit 8.33 mM'lik çözelti hazırlayın deoksijene deiyonize su. Magnetoferritin sentezi s manyetik (aynı zamanda apo-ferritin çözeltisi içine demir-kobalt ön ve hidrojen peroksit hem de 10.1 ml enjektetirred), iki şırınga pompası kullanılarak / dakika 0.15 ml bir akış hızında (toplam hacim enjekte: 20.2 mi) eklendi. Enjeksiyon süresi boyunca deiyonize su, 500 ml oksilenlendirilmesi. Not: reaksiyon kabının içerikleri yavaş yavaş reaksiyon ilerledikçe, koyu kahverengi bir renk kabul eder. Kısaca, ilk enjeksiyondan tamamlanmasından önce, demir-kobalt ön ve taze deoksijene deiyonize su kullanarak hidrojen peroksit çözeltisi bir 100 ml hazırlanır. demir-kobalt ve bir hidrojen peroksit taze hazırlanmış solüsyonları kullanılarak 1.3.1 tarif edilen enjeksiyon adımı tekrar edin. Enjeksiyon süresi boyunca deiyonize su, 500 ml oksilenlendirilmesi ve 1.3.3 ve 1.3.4 tarif edildiği gibi devam edin. üçüncü enjeksiyondan sonra, karıştırılarak 15 dakika boyunca olgunlaşmaya çözeltisi bırakın. çözelti içinde serbest metal iyonlarının kenetlenmesi için tepkime kabına 1 M sodyum sitrat çözeltisi 1.5 ml ilave edilir. reaksiyonundan çözüm çıkarın50 ml santrifüj tüplerine, 4,350 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj ve 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek süpernatan geçmesi halinde damar. Bu aşamada, süzüldü üst fazı saflaştırma kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. İyon değişim kromatografisi 10 ml / dk bir akış oranında bir peristaltik pompa kullanılarak bir katyonik matris ihtiva eden bir kolon (20 cm uzunluğunda, 2.5 cm çapında) üzerine örnek yükleyin. 10 ml / dk bir akış oranında bir gradyan pompası kullanılarak tamponu (50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS) tamponu, pH 8.0) içinde çalışan yaklaşık olarak 100 ml kolon yıkayın. 150, 500 ve 1000 mM son NaCl konsantrasyonu, her bir konsantrasyonu, 150 ml: protein elüt edilmesi için Tris tamponu içinde sodyum klorür (NaCl) artan konsantrasyonları ile 10 ml / dk bir sütun yıkayın. Protein, 500 mM NaCl konsantrasyonunda elüte olur olarak, otomatik bir kısım toplayıcısı kullanılarak ve 50 ml'lik kısımlar halinde, toplayın. NOT: İçiniyon değişim kromatografisi detaylı protokol daha önce yayınlanmış protokolleri danışın. 26 Ebat eksklüzyon kromatografı 4 ml hacim birimi tarafından takip edilen 15 ml santrifüj filtre ünitesi kullanılarak yaklaşık 2 ml'lik bir hacme kadar magnetoferritin 150 ml konsantre edilir. Bu prosedürün detaylı bir protokol için santrifüj filtre ünitelerinin üreticinin talimatlarına (malzeme listesine bakınız) başvurun. bir enjeksiyon döngüsü kullanılarak jel süzme sütunu üzerine konsantre edildi örnek yükleyin. 1.3 ml / dakika bir akış hızında (150 mM NaCl ihtiva eden 50 mM Tris tamponu, pH 8.0) tampon maddesi ile sütunun yıkayın. otomatik bir kısım toplayıcısı kullanılarak ve 6 ml fraksiyonlar toplanır. Protein monomerleri son Zehir. Bu noktada, arıtılmış, magnetoferritin Katyonikleştirme kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Not: bir jel filtrasyon kolonu kullanılarak büyüklük dışlama kromatografisi ayrıntılı bir protokoldür bakınız için oncekiusly protokolleri yayınladı. 27 Protein konsantrasyonunun saptanması ticari olarak temin edilebilen bir at dalak ferritin kullanılarak 50 mM Tris tamponu içinde 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 ve 1 mg / ml ferritin standartları hazırlayın. NOT: piyasada mevcut ferritin protein konsantrasyonu şişe belirtilmiştir. Değilse, bu bilgi için sağlayıcısına başvurun. Çözeltinin rengi, yaklaşık 0.5 mg / ml standart renk aynı oluncaya kadar 50 mM Tris tamponu içinde bilinmeyen bir konsantrasyon magnetoferritin örnekleri seyreltilir. seyreltme faktörü bir yere not edin. 96 gözlü bir levhanın gözleri içine üç kopya halinde her bir standart ve magnetoferritin örnek 10 ul ekle. (Bradford tahlil reaktif ayrıntılar için malzemeler listesine bakın) her kuyuya hazır Bradford reaktifi 200 ul ekleyin. 8 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. Kullanılarak λ = 595 nm absorbans ölçümübir mikroplaka okuyucu. Protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak ferritin standartların ortalama absorbans Konu ve magnetoferritin numunenin konsantrasyonunu hesaplamak için doğrusal bir uyum eğim ve kesişme kullanın. NOT: hesaba standart eğrisine magnetoferritin örneği ayarlamak için kullanılan seyreltme faktörünü alın. 2. Magnetoferritin Katyonikleştirme Genel açıklamalar Not: magnetoferritin Katyonikleştirme için, N, N-dimetil-1,3-propandiamin (DMPA) N- MF yüzeyinde aspartik ve glutamik asit kalıntısı elde etmek birleştirilmiştir – (3-dimetilaminopropil) – etilkarbodiimid hidroklorid (EDC) eklenmiştir. karıştırma altında oda sıcaklığında reaksiyonu yürütmek. Aşağıda verilen protokol, 5 ml (protein konsantrasyonu 2 mg / ml) 'in bir toplam hacim içinde magnetoferritin 10 mg Katyonikleştirme içindir. Ancak, yukarı veya aşağı ölçeklemeDMPA: EDC oranları tutarlı olarak tampon ve magnetoferritin çözeltisi hacimleri protein tutarak. Katyonikleştirme reaksiyonu öncesinde, 50 mM NaCl içeren 50 mM fosfat tamponu (pH 7) içine magnetoferritin örnekleri dialyze. Bu Tris elüsyon tamponunu çıkarın ve Tris amin ve EDC ile aktive edilen karboksilik asit kalıntıları arasında, istenmeyen reaksiyonları önlemek için önemlidir. diyalizden sonra protein konsantrasyonu belirlemek ve / ml önce Katyonikleştirme 4 mg ayarlayın. Katyonikleştirme protokolü DMPA 374 mg tartılır ve 200 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) tamponunda 2.5 ml içinde çözülür. konsantre edildi (6 M) hidroklorik asit (HCI) kullanılarak çözelti, pH yaklaşık 7 ayarlayın. DİKKAT: Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin, DMPA'nın için asit ilavesi olarak toksik dumanlar bültenleri! 4 mg / ml'de magnetoferritin solüsyonu 2.5 ml (son yoğunlaştırmaMES trasyonu 100 mM, magnetoferritin nihai konsantrasyonu / ml toplam protein miktarı 10 mg), 2 mg olmasıdır. Bir manyetik karıştırıcı ilave edin ve 2 saat dengelenmeye karıştırılır. Dikkatle 1 M HCI kullanılarak pH değeri 5.0 çözelti ayarlayın. DMPA / magnetoferritin çözeltisine EDC tozun 141 mg ekleyin. 3.5 saat boyunca karıştırmaya devam edin. Herhangi bir çökeltileri uzaklaştırmak için 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti filtre. Diyaliz tamponu yerine bir 12-14 kDa molekül ağırlığı kesmesi ile diyaliz tüp solüsyonu ilave edildi ve 4 ° C 'de 2 gün boyunca, 50 mM NaCl içeren 50 mM fosfat tamponu (pH 7) 4 L karşı diyaliz En az üç o dönemde kez. NOT: Bu noktada, katyonize magnetoferritin sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir. Katyonize Magnetoferritin ile 3. İnsan Mezenkimal Kök Hücre Etiketleme Genel açıklamalar <li> 37 ° C ve% 5 karbondioksit atmosferinde sınıf II laminer akış dolapları ve nemlendirilmiş inkübatör kullanan tüm hücre kültürü gerçekleştirin. 4 gün – tek tabakaları 175 cm 2 şişe ve her 3 doldurulan kültür ortamı, 20 ml kullanılarak kültür hücreleri. Kültür ortamı 1.000 mg / L glikoz,% 10 (h / h) cenin sığır serumu,% 1 (h / h), penisilin / streptomisin solüsyonu,% 1 ihtiva eden, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) oluşan (h / h) L alanil-L-glutamin çözeltisi ve 5 ng / taze takviye ml insan fibroblast büyüme faktörü. Katyonize magnetoferritin ile hMSC Manyetik etiketleme Tohum 150,000 25 cm2 şişelere hMSCs ve gece boyunca 37 ° C uygun bırakın. Filtre 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek katyonize magnetoferritin sterilize ve protein konsantrasyonu belirlenir. steril koşullar tutulması, katyonize magnetoferri bir 0.5 uM çözelti hazırlamakfosfat, kalay tuz (PBS) tamponlu. kullanılana kadar steril bir kültürü kaputu şapkalı tutun. Oda sıcaklığında 2 ml PBS ile kaplı hücreler yıkanır. tabakalanmış hücrelere sterilize katyonize magnetoferritin çözeltisi 1 ml ilave edilir ve arzu edilen bir süre (1 dakika ile 1 saat) inkübe edilir. tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 0.5 ml ilave edildikten ve 5 dakika için 37 ° C 'de enkübe edilerek hücreler PBS ile, ve daha sonra, hasat hücreleri yıkayın. , Tripsin / EDTA inaktive 524 x g'de 5 dakika boyunca 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj çözelti aktarmak için kültür ortamı 1 ml ilave edilir. Süpernatant atılır ve fetal sığır serumu ve PBS içinde 2 mM EDTA (w / v)% 0,5 oranında içeren, 0.5 ml hücre pelletini manyetik ayırma tamponu yeniden askıya. Manyetik Hücre Ayırma Çok standa mıknatıs takın ve mıknatıs manyetik ayırma sütun ekleyin. th bir ön ayırma filtresi yerleştirine sütunu. ön ayırma filtresi manyetik ayırma tampon 0.5 ml yerleştirin ve filtre ve yıkama ve onları ıslak sütununda hem aracılığıyla çalışmasına izin verin. sütununun altında bir 15 ml santrifüj tüpüne koyun. manyetik ayırma kolonu filtre haznesinde hücre süspansiyonu, 0.5 ml ilave edilir. hazne boşaldığında, manyetik ayırma tamponu, 0.5 ml ekleyin. hazne boşaldığında, manyetik ayırma tamponu ilave 0.5 ml ekleyin. Bir kez daha (1.5 mi olmalıdır yıkama için kullanılan manyetik ayırma tamponu toplam hacim) tekrarlayın. Bu yıkama adımı sütunu (non-manyetize hücre fraksiyonu) olmayan tüm mıknatıslanmış hücreleri ayrışır. Mıknatıs sütunu çıkarmak ve yeni bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne koyun. Sütun deposunun filtresini çıkartınız. hazneye manyetik ayırma tamponu 1 ml ilave edilir ve üretimi ile birlikte piston kullanılarak sütun üzerinden itme anındar. Bu santrifüj tüpüne (manyetize hücre fraksiyonu) halinde kolondan manyetize edilmiş hücreler çözülür. Santrifüj 524 x g'de 5 dakika boyunca her iki tüp. Süpernatantı atın ve 0.3 ml PBS içinde hücre pelletleri yeniden askıya. hemasitometre kullanarak her fraksiyon hücreler sayıların sayısını. Manyetize edilmiş hücrelerin oranını tespit, E (%), aşağıdaki denklem kullanılarak: N (M) manyetize edilmiş fraksiyon ve n hücre sayısı olduğu (M + NM) manyetize olmayan manyetize fraksiyonlarda hücrelerin sayısı toplamıdır. Indüktif eşleşmiş plazma optik emisyon spektroskopisi kullanarak demir ölçümü için katyonize magnetoferritin ile etiketlenmiş hMSCs hazırlanması (ICP-OES) NOT: protokol diğer ICP-OES araçlar için adapte edilmesi gerekebilir. Yeniden danışmak tavsiye edilirmından kendiniz sorumlusunuz teknisyeni. x g'de 524 5 dakika için bir hücre bilinen numarasını santrifüjleyin. PBS Süpernatantı ve% 50 (h / h), nitrik asit, 0.25 ml ekleyin. Vortex asitleştirilmiş hücre süspansiyonu karıştırın. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Her bir numune ve vorteks karışımına damıtık su 4.75 ml ilave edilir. ICP-OES ile analiz edin. 28 Hücresel demir içeriğinden bir değeri belirlemek için hücre sayısı ölçülen demir normalize edilecektir.