JoVE Journal > Bioengineering
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物工学

Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

Published: December 13, 2016
doi:
10.3791/54785
, , , , ,
1Bristol Centre for Functional Nanomaterials,University of Bristol, 2Department of Materials,Imperial College London, 3Self Assembly Group,CIC nanoGUNE, 4Ikebasque, Basque Foundation for Science, 5School of Cellular and Molecular Medicine,University of Bristol, 6H.H. Wills Physics Laboratory,University of Bristol

概要

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Abstract

Veel belangrijke biomedische toepassingen, zoals cell imaging en manipulatie op afstand kan worden bereikt door het merken van cellen met superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPIONs). Het bereiken van voldoende cellulaire opname van SPIONs is een uitdaging die van oudsher heeft voldaan door het blootstellen van cellen aan verhoogde concentraties van SPIONs of door het verlengen van belichtingstijden (tot 72 uur). Deze strategieën zullen waarschijnlijk toxiciteit bemiddelen. Hier presenteren we de synthese van het eiwit gebaseerde SPION magnetoferritin en een gemakkelijke oppervlak functionalisering protocol dat snelle magnetisatie cel maakt gebruik van lage concentraties blootstelling. De SPION kern van magnetoferritin bestaat uit kobalt gedoteerd ijzeroxide met een gemiddelde deeltjesdiameter van 8,2 nm gemineraliseerde in de holte van het paard milt apo-ferritine. Chemische kationisatie van magnetoferritin produceerde een nieuw, zeer membraan-actieve SPION dat de menselijke mesenchymale stamcellen gemagnetiseerd (hMSCs) met behulp van incubatie keer zokort als een minuut en ijzer concentraties dieptepunten als 0,2 mm.

Introduction

Oppervlaktebinding of internalisatie van superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPIONs) heeft magnetisatie van verschillende celtypes ingeschakeld voor toepassingen zoals beeldvorming en manipulatie op afstand. 1 Het realiseren voldoende cellulaire magnetisatie kan een uitdaging zijn, vooral wanneer de interactie tussen de SPION en het celoppervlak zwak. 2 In het verleden, langdurige blootstelling of hoge SPION concentraties zijn gebruikt als strategieën om dit probleem te ondervangen. 3,4 Niettemin deze strategieën zijn problematisch omdat ze toxiciteit verhogen en 5,6 zeer beperkt succes celtypen internaliseren lage prijzen, zoals lymfocyten. 7 Om cellulaire opname van SPIONs verbeteren, hebben verscheidene oppervlakte functionalisering benaderingen onderzocht. Zo zijn antilichamen gebruikt om receptor-gemedieerde endocytose, 8 bevorderen terwijl niet-specifieke opname kan worden verkregen door transfectie van eenheren 9,10 of celpenetrerende species, zoals HIV tat-peptide. 11,12 Echter, antilichaam en peptide functionalisering benaderingen worden beperkt door dure reagentia en complexe synthetische voorbereiding, terwijl transfectie agenten nanodeeltje neerslag kan veroorzaken en een negatieve invloed hebben op de celfunctie. 13,14

Onlangs meldde de synthese van chemisch gekationiseerd magnetoferritin, een nieuwe SPION die zeer effectief magnetiseren menselijke mesenchymale stamcellen was (hMSCs) middels incubatietijden zo kort als één minuut. 15 Magnetoferritin wordt bereid door reconstitutie van een SPION binnen de gedemineraliseerd holte van het strijkijzer ferritine. 16 Dit eiwit gebaseerde SPION combineert veel eigenschappen die het zeer geschikt maken voor mobiele magnetisatie, zoals controle over de magnetische eigenschappen van de magnetische kern, 17-19 en biologische verenigbaarheid en oplosbaarheid van de proteïne shell verleend. Verdermeer, het oppervlak functionalisering gemakkelijk gerealiseerd door adresseerbare aminozuren die chemisch of genetisch gemodificeerde 20-22. 23-25 We hebben aangetoond dat de chemische kationisering van de zure aminozuurresten van het eiwit shell genereert een stabiele nanodeeltjes die gemakkelijk in wisselwerking met anionogene domeinen op het celoppervlak leidt tot een snelle en aanhoudende cel magnetisatie. Deze werkwijze elimineert de noodzaak voor moeizame functionalisering en langdurige incubatie protocollen, en vanwege de etikettering mechanisme aspecifieke deze snelle magnetisatie strategie wijdverspreide toepassing in andere celtypen moeten vinden. Hier presenteren we een diepgaande verslag van de ultra-fast cel labeling methode, inclusief gedetailleerde protocollen van de synthese, zuivering en oppervlakte functionalisering van gekationiseerde magnetoferritin.

Protocol

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) werden geoogst uit de proximale femur beenmerg van osteoarthritic patiënten die een totale heupprothese chirurgie, in volledige overeenstemming met de richtlijnen van Bristol Southmead Hospital Research Ethics Committee (referentie # 078/01) en na toestemming van de patiënt werd verkregen. 1. Magnetoferritin Synthese en zuivering Algemene opmerkingen Voeren magnetoferritin synthese in een afsluitbare, dubbele mantel reactievat bij 65 ° C onder stikstofatmosfeer om oxidatie van het metaal voorlopers beperken. Injecteren metalen zoutoplossingen en waterstofperoxide door de toegangspoorten in het deksel in het reactievat met behulp van een injectiepomp. Na magnetoferritin synthese zuiveren het eiwit door anionenuitwisselingschromatografie (zie paragraaf 1.4) aan nanodeeltjes niet in het eiwit omsloten holte, gevolgd door grootte-uitsluitingschromatografie verwijderen (zie paragraaf 1.5) eiwit monomeren isoleren. determine eiwitconcentratie met behulp van een Bradford assay (zie paragraaf 1.6). Voorbereidingen voor de synthese Deoxygenate 500 ml gedeïoniseerd water door een buis verbonden met een stikstofgas fles van water, het afdichten van het vat met plasticfolie en doorborrelen van stikstofgas gedurende ongeveer 60 minuten. Verwarm een ​​waterbad verbonden met een dubbele mantel reactievat tot 65 ° C. Voeg 75 ml 50 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) buffer (pH 8,6) in het reactievat, sluit het vat en deoxygenate door stikstof gas door de bufferoplossing gedurende ongeveer 20 minuten. Tegelijkertijd, roer de bufferoplossing met een magneetroerder. Na deoxygenating de HEPES-buffer oplossing, verwijder de buis toevoeren van het stikstofgas uit de buffer en te houden opgehangen in het vaartuig naar een stikstofatmosfeer te handhaven. Add apo-ferritine tot een eindconcentratie van 3 mg / m te bereikenl. Ga door met de magnetisch roeren, maar het verminderen van de roersnelheid indien schuimvorming optreedt. Bereid een 25 mM voorraadoplossing van kobalt-heptahydraat door het oplossen van 0,19 g in 50 ml gedeoxygeneerd gedeioniseerd water. Bereid een 25 mM oplossing van ammoniumchloride ijzersulfaat hexahydraat oplossing door het oplossen van 0,98 g in 100 ml gedeoxygeneerd gedeioniseerd water. Verwijderen 2,5 ml ammonium ijzersulfaat hexahydraat oplossing en vervangen door 2,5 ml van de kobalt sulfaat heptahydraat. Bereid een 8,33 mM oplossing van waterstofperoxide in gedeoxygeneerd gedeioniseerd water door eerst 965 pl van een waterstofperoxideoplossing (30% w / w) tot 9 ml gedeoxygeneerd gedeioniseerd water en vervolgens het toevoegen van 1 ml van deze sub-beelden tot 99 ml van gedeoxygeneerd gedemineraliseerd water. Magnetoferritin synthese Injecteer 10,1 ml van zowel de ijzer-kobalt precursor en het waterstofperoxide gelijktijdig in de apo-ferritine oplossing (magnetisch stirred) bij een stroomsnelheid van 0,15 ml / min met twee spuitpomp (totale injectiehoeveelheid: 20,2 ml). Tijdens de injectieperiode, deoxygenate een 500 ml gedeïoniseerd water. OPMERKING: De inhoud van het reactievat en geleidelijk een donkerbruine kleur wanneer de reactie voortgaat. Kort vóór de voltooiing van de eerste injectie bereid een 100 ml ijzer-kobalt precursor en waterstofperoxide oplossing met de vers gedeoxygeneerd gedeioniseerd water. Herhaal de injectiestap in 1.3.1 met vers bereide oplossingen van ijzer-kobalt en waterstofperoxide. Tijdens de injectie periode deoxygenate nog eens 500 ml gedemineraliseerd water, en ga verder zoals beschreven in 1.3.3 en 1.3.4. Na de derde injectie laat de oplossing rijpen 15 minuten onder roeren. Voeg 1,5 ml van een 1 M natriumcitraatoplossing aan het reactievat te cheleren vrije metaalionen in oplossing. Verwijder de oplossing van het reactiemengselverblijf in 50 ml centrifugebuizen gecentrifugeerd gedurende 30 minuten bij 4350 xg en het supernatant passeren door een 0,22 urn spuitfilter. In dit stadium kan de gefiltreerde supernatant worden bewaard bij 4 ° C tot de zuivering. Ionenuitwisselingschromatografie Laad het monster op een kolom (2,5 cm diameter, 20 cm lang) met een kationisch matrix met behulp van een peristaltische pomp met een stroomsnelheid van 10 ml / min. Was de kolom met ca. 100 ml loopbuffer (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris) buffer, pH 8,0) met een gradiënt pomp met een stroomsnelheid van 10 ml / min. Om het eiwit te elueren, was de kolom met 10 ml / min met toenemende concentraties van natriumchloride (NaCl) in Tris-buffer: 150, 500 en 1000 mM NaCl uiteindelijke concentratie 150 ml elke concentratie. Aangezien het eiwit elueert bij een NaCl concentratie van 500 mM, verzamelen in 50 ml fracties onder gebruikmaking van een geautomatiseerde fractiecollector. LET OP: Voor eengedetailleerd protocol van ionenuitwisselingschromatografie raadplegen eerder gepubliceerde protocollen. 26 Gelpermeatiechromatografie Concentreer het 150 ml magnetoferritin tot een volume van ongeveer 2 ml met een 15 ml centrifugale filtereenheid gevolgd door 4 ml volume-eenheid. Raadpleeg de instructies van de centrifugale filter-eenheden van de fabrikant (zie materiaal lijst) voor een gedetailleerd protocol van deze procedure. Laad de geconcentreerde monster op een gelfiltratiekolom met behulp van een injectie lus. Was de kolom met loopbuffer (50 mM Tris buffer, pH 8,0, bevattende 150 mM NaCl) met een stroomsnelheid van 1,3 ml / min. Verzamel 6 ml fracties onder gebruikmaking van een geautomatiseerde fractiecollector. Eiwit monomeren elueren laatste. Op dit punt kan gezuiverd magnetoferritin worden opgeslagen bij 4 ° C tot kationisering. LET OP: Voor een gedetailleerd protocol van gelpermeatiechromatografie met behulp van een gelfiltratiekolom raadplegen previously gepubliceerde protocollen. 27 Bepalen eiwitconcentratie Bereid ferritine niveau van 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 en 1 mg / ml in 50 mM Tris buffer met behulp van commercieel verkrijgbaar paard milt ferritine. LET OP: Het eiwit concentratie van commercieel verkrijgbare ferritine staat vermeld op de fles. Zo niet, dan contact op met de leverancier voor deze informatie. Verdun magnetoferritin monsters van onbekende concentratie in 50 mM Tris buffer totdat de kleur van de oplossing ongeveer overeenkomt met de kleur van de 0,5 mg / ml standaard. Maak een notitie van de verdunningsfactor. Voeg 10 ul van elke standaard en magnetoferritin monster in drievoud in putjes van een plaat met 96. Voeg 200 ul van kant-en-klare Bradford reagens aan elk putje (zie materialen lijst voor Bradford assay reagens details). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 8 minuten. Meet de absorptie bij λ = 595 nm met behulpeen microplaat reader. Zet de gemiddelde absorptie van de ferritine standaarden als een functie van eiwitconcentratie en gebruik de helling en intercept van de lineaire regressie van de concentratie van de magnetoferritin monster. LET OP: Houd rekening met de verdunningsfactor die werd gebruikt om de magnetoferritin monster naar de standaard curve aan te passen. 2. Magnetoferritin kationisatie Algemene opmerkingen OPMERKING: magnetoferritin kationisering, N, N-dimethyl-1,3-propaandiamine (DMPA) werd gekoppeld aan asparaginezuur en glutaminezuur residuen op de MF oppervlak onder toepassing van N – (3-dimethylaminopropyl) – N-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC). Uitvoeren van de reactie bij kamertemperatuur onder roeren. Het protocol is hieronder voor de kationisering van 10 mg magnetoferritin in een totaal volume van 5 ml (eiwitconcentratie 2 mg / ml). Echter, schaal omhoog of omlaagdoor het houden van het eiwit: DMPA: EDC verhoudingen consistent, evenals de omvang van de buffer en magnetoferritin oplossing. Voorafgaand aan de reactie kationisering, dialyseer de magnetoferritin monsters in 50 mM fosfaatbuffer (pH 7) die 50 mM NaCl. Dit is belangrijk om Tris elutiebuffer verwijderd en ongewenste reacties tussen de Tris amine en EDC-geactiveerde carbonzuur residuen te voorkomen. Bepaal de eiwitconcentratie na dialyse en afstellen op 4 mg / ml voorafgaand aan kationisering. kationisatie protocol Weeg 374 mg DMPA en los op in 2,5 ml van 200 mM 2- (N -morpholino) ethaansulfonzuur (MES) buffer. Stel de pH van de oplossing tot ongeveer 7 met geconcentreerd (6 M) zoutzuur (HCl). LET OP: Voer deze stap in een zuurkast, als toevoeging van het zuur aan DMPA doet giftige dampen! Voeg 2,5 ml magnetoferritin oplossing met 4 mg / ml (uiteindelijke concentratie van 100 mM MES, eindconcentratie magnetoferritin is 2 mg / ml, totaal eiwit 10 mg). Voeg een magnetische roerder en roer gedurende 2 uur equilibreren. pas voorzichtig tot pH 5,0 onder gebruikmaking van 1 M HCl. Voeg 141 mg van EDC poeder aan het DMPA / magnetoferritin oplossing. Verder roeren gedurende 3,5 uur. Filtreer de oplossing door een 0,22 pm spuitfilter om eventuele neerslag te verwijderen. Voeg de oplossing voor dialyse buis met een 12-14 kDa molecuulgewicht cut-off en dialyseren tegen 4 liter 50 mM fosfaatbuffer (pH 7) die 50 mM NaCl gedurende 2 dagen bij 4 ° C, ter vervanging van de dialyse buffer ten minste drie keer in die periode. OPMERKING: Op dit punt kan gekationiseerde magnetoferritin worden bewaard bij 4 ° C tot verder gebruik. 3. menselijke mesenchymale stamcellen Labeling met gekationiseerd Magnetoferritin Algemene opmerkingen <li> Voer alle celkweek met klasse II laminaire luchtstroomkast en bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% kooldioxideatmosfeer. Kweekcellen als monolagen via 175 cm2 flessen en 20 ml kweekmedium, die elke 3 werd bijgevuld – 4 dagen. Het kweekmedium bestond uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), die 1000 mg / l glucose, 10% (v / v) foetaal runderserum, 1% (v / v) penicilline / streptomycine-oplossing, 1% (v / v) L -alanyl-L-glutamine-oplossing en 5 ng / ml vers aangevuld humane fibroblast groeifactor. Magnetische etikettering van hMSC met gekationiseerd magnetoferritin Seed 150.000 hMSCs in 25 cm 2 flessen en laat een nacht bij 37 ° C houden. Filter steriliseer gekationiseerd magnetoferritin door een 0,22 urn spuitfilter en bepaal de eiwitconcentratie. Het houden van steriele omstandigheden, bereiden een 0,5 uM oplossing van gekationiseerd magnetoferritin in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd afgedekt in een steriele cultuur kap tot gebruik. Was de cellen bedekt met 2 ml PBS kamertemperatuur. Voeg 1 ml van de gesteriliseerde oplossing gekationiseerde magnetoferritin de geplateerde cellen en incubeer gedurende de gewenste periode (1 min tot 1 uur). Was de cellen met PBS, en vervolgens oogsten cellen door toevoeging van 0,5 ml trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en incubatie bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 1 ml kweekmedium de trypsine / EDTA inactiveren, breng de oplossing over een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 524 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 0,5 ml magnetische scheiding buffer, bestaande uit 0,5% (w / v) foetaal runderserum en 2 mM EDTA in PBS. Magnetische celscheiding Bevestig de magneet op de multi-stand en voeg een magnetische scheidingskolom naar de magneet. Plaats een pre-scheidingsfilter op The kolom. Plaats 0,5 ml van magnetische scheiding buffer in de pre-scheidingsfilter en laat deze via zowel de filter en de kolom te wassen en nat maakt. Plaats een 15 ml centrifugebuis in de kolom. Voeg 0,5 ml van de celsuspensie in de filter reservoir van de magnetische scheidingskolom. Als het reservoir leeg is, voeg 0,5 ml van magnetische scheiding buffer. Als het reservoir leeg is, nog extra 0,5 ml magnetische scheiding buffer. Nog een keer herhalen (het totale volume van magnetische scheiding buffer gebruikt voor het wassen dient 1,5 ml). Deze wasstap elueert alle niet-magnetische cellen uit de kolom (niet-gemagnetiseerd celfractie). Verwijder de kolom uit de magneet en plaats deze in een verse 15 ml centrifugebuis. Verwijder filter uit de kolom reservoir. Voeg 1 ml van magnetische scheiding buffer om het reservoir en druk direct door de kolom met de door de fabrikant geleverde plunjerr. Dit elueert de gemagnetiseerde cellen uit de kolom in de centrifugebuis (gemagnetiseerd celfractie). Centrifuge beide buizen gedurende 5 minuten bij 524 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellets in 0,3 ml PBS. Tel het aantal cellen getallen in elke fractie met een hemocytometer. Bepaal de fractie van gemagnetiseerde cellen, M (%) met de volgende vergelijking: waarbij n (M) is het aantal cellen in de gemagnetiseerde fractie en n (M + NM) is de som van het aantal cellen in de gemagnetiseerde en niet gemagnetiseerde fracties. Het voorbereiden van hMSCs gemerkt met gekationiseerd magnetoferritin voor ijzer kwantificering met behulp van inductief gekoppelde plasma optische emissie spectroscopie (ICP-OES) OPMERKING: Het protocol moet mogelijk worden aangepast voor andere ICP-OES instrumenten. Het is raadzaam om te overleggen met de rewoordelijk technicus. Centrifugeren een bekend aantal cellen gedurende 5 minuten bij 524 x g. Verwijder de PBS supernatant en voeg 0,25 ml 50% (v / v) salpeterzuur. Vortex meng de verzuurde celsuspensie. Incubeer overnacht bij kamertemperatuur. Voeg 4,75 ml gedestilleerd water aan elk monster en vortex mix. Analyseer met ICP-OES. 28 Normaliseren van de gemeten ijzergehalte van het aantal cellen een waarde voor mobiele ijzergehalte te bepalen.

Representative Results

TEM werd gebruikt om nanodeeltjes mineralisatie in de holte apoferritine bevestigen en bepaal de gemiddelde kerndiameter (Figuren 1A en 1B). Beeldanalyse van ongekleurde magnetoferritin monsters gaven een gemiddelde kerndiameter van 8,2 ± 0,7 nm, en aurothioglucose vlek bevestigde de aanwezigheid van nanodeeltjes in het eiwit kooi. Merk op dat de beelden tonen een magnetoferritin monster dat verder werd gezuiverd met behulp van magnetische scheiding uniforme nanodeeltjes kernen te isoleren. Magnetoferritin monsters die niet magnetisch zijn gezuiverd hebben een iets bredere kern grootteverdeling. 29 Analyse van de structuur van de magnetoferritin kern via geselecteerde gebied elektronendiffractie aangegeven mogelijke aanwezigheid van de inverse spinel structuur met magnetiet (Fe 3 O 4) en / of maghemiet (γ-Fe 2 O 3), alsmede de spinelstructuur door Co 3 </sub> O 4. Bovendien Raman spectra toonde pieken toegeschreven aan Fe 3 O 4, kleine hoeveelheden γ-Fe 2 O 3, en een kobaltferriet (Figuur 1 C). ICP-OES analyse magnetoferritin vertoonden gemiddeld 102 ug ijzer en 0,9 ug kobalt per milligram magnetoferritin. Een schema is opgenomen, illustreren de volgende kationisatie stap (figuur 2 A). De hydrodynamische diameter van magnetoferritin en gekationiseerde magnetoferritin was 11,8 ± 1,1 nm en 12,5 ± 1,4 nM, zoals bepaald door dynamische lichtverstrooiing. De kationisering efficiëntie covalente DMPA-koppeling aan magnetoferritin werd gemeten met zeta potentiometrie en MALDI time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie. De zetapotentiaal veranderd van -10,5 mV voor MF tot + 8,3 mV voor gekationiseerd magnetoferritin bevestigt eenverandering in oppervlaktepotentiaal van negatief naar positief (tabel 1). Massaspectrometrie experimenten vond een subunit moleculair gewicht van 20,1 kDa voor natief apo-ferritine en 21,1 kDa voor gekationiseerd apo-ferritine (figuur 2 B). Deze massatoename overeen met ongeveer 12 gekoppelde DMPA moleculen per eiwit subeenheid en de kationisering van 288 resten op de gehele 24-subeenheid-eiwit. Magnetische verzadiging en gevoeligheid werden gemeten met SQUID magnetometrie en transversale en longitudinale relaxatie werden gemeten met behulp van magnetische resonantie beeldvorming. Magnetische eigenschappen waren vergelijkbaar voor magnetoferritin en gekationiseerd magnetoferritin, wat aangeeft dat kationisatie had verwaarloosbaar effect op de magnetische eigenschappen van de ingesloten SPION (tabel 1). Bovendien zijn deze eigenschappen zijn vergelijkbaar met andere ijzeroxide gebaseerde nanodeeltjes, 19,30 aantonen dat Magne gekationiseerdtoferritin zou net zo geschikt zijn als conventionele-SPION gebaseerde MRI-contrastmiddelen bij het verbeteren van beeldvorming contrast zijn. Na blootstelling gedurende 30 minuten, werd het celoppervlak dicht met gekationiseerd magnetoferritin (Figuur 3A). Echter, na één week werden geen nanodeeltjes gevonden op het celoppervlak (figuur 3 B). Gekationiseerd magnetoferritin was opmerkelijk effectief bij het magnetisch etikettering hMSCs. Met name, het blootstellen van de cellen aan gekationiseerd magnetoferritin één minuut resulteerde in de magnetisatie van 92% van de celpopulatie en het leveren van 3,6 ug ijzer per cel. Verhogen van de incubatietijd 15 minuten resulteerde in de magnetisatie van de gehele celpopulatie (figuur 3 C). Figuur 1: Analyse van magnetof erritin kernen gedoteerd met 5% cobalt. TEM beelden van magnetoferritin gekleurd met aurothioglucose (A) en niet gekleurd (B). Inzet toont bijbehorende elektron diffractie met magnetiet indices. Schaal bar: 20 nm. (C) Raman spectrum voor magnetoferritin. De pijlen geven de belangrijkste Raman trillingen modi voor kobalt ferriet (T 2g), magnetiet en maghemiet (zowel A 1 g). 31,32 De lasergolflengte gebruikt was 532 nm. (Afbeelding aangepast van Okuda et al. 18). Merk op dat deze magnetoferritin steekproef was verder gezuiverd met behulp van magnetische scheiding, die uniform geladen deeltjes magnetoferritin geïsoleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 785fig2.jpg "/> Figuur 2: kationisering van magnetoferritin. A) oplosmiddel toegankelijk oppervlak voorstellingen die de verdeling van zure (rood) en basis (geel) aminozuur residuen op het eiwit oppervlak. Magnetoferritin (1) is aangepast om gekationiseerd magnetoferritin (2) door carbodiimide-gemedieerde verknoping van DMPA zure aminozuur residuen op het eiwit oppervlak (3). B) Massaspectrometrie analyse van de apo-ferritine en gekationiseerd apo-ferritine subeenheden. Massa-tot-lading (m / z) spectrum van apoferritine (ApoF) en gekationiseerd apoferritine (cat-ApoF) met MALDI-TOF. Een massale toename van 20,1 kDa tot 21,1 kDa is waargenomen na kationisering. (Afbeelding aangepast van Correia Carreira et al. 15) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Figuur 3: Magnetic etikettering en cel scheiding van hMSCs geïncubeerd met gekationiseerde magnetoferritin. A) TEM beeld van hMSCs na 30 minuten incubatie met gekationiseerde magnetoferritin. De pijl geeft de aanwezigheid van magnetoferritin kernen dicht gepakt op het celoppervlak. Schaal bars: 200 nm. B) TEM beeld van hMSC een week na labeling. Het celoppervlak is duidelijk van gekationiseerde magnetoferritin. C) het onderzoeken van de snelheid van de magnetische etikettering: 92% van de celpopulatie werden gemagnetiseerd na een minuut belichting met 0,5 uM gekationiseerd magnetoferritin, en de hele celpopulatie werd gemagnetiseerd binnen 15 minuten. Ijzergehalte per cel werd bepaald met behulp van ICP-OES. Gemiddelde en de standaarddeviatie van drie biologische herhalingen worden getoond. (Afbeelding aangepast van Correia Carreira et al. 15) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. MF cat-MF Hydrodynamische diameter [nm] 11,8 ± 1,1 12,5 ± 1,4 Zeta potentieel [mv] (-) 10,4 ± 0,2 8,3 ± 0,7 Magnetische verzadiging moment dat [Am 2 kg -1] 54,9 ± 1,6 55,3 ± 1,4 Mass gevoeligheid [x 10 4 m 3 kg -1] 1,75 ± 0,08 1,75 ± 0,07 Longitudinale relaxatie [mm -1 sec -1] 2,6 ± 0,1 2.3 ± 0.1 Transversale relaxatie [mM -1 sec -1] 44,6 ± 1,0 52,8 ± 0,8 Tabel 1: Fysisch-chemische karakterisering van magnetoferritin (MF) en gekationiseerd magnetoferritin (cat-MF). (Tabel aangepast van Correia Carreira et al. 15)

Discussion

TEM van magnetoferritin monsters gekleurd met aurothioglucose onthulde de succesvolle mineralisatie van nanodeeltjes in het eiwit kooi. Elektronendiffractie en Raman analyse van het nanodeeltje kern gaf de aanwezigheid van een kobaltferriet, aangeeft succesvolle dotering van het nanodeeltje kern met kobalt. Dit toont aan dat gemengde oxide nanodeeltjes met succes binnen de gemineraliseerde apo-ferritine holte kan worden. Verder hebben we aangetoond dat eerder kobalt dotering kan worden gevarieerd door het veranderen van de hoeveelheid cobalt precursor toegevoegd aan het reactiemengsel, dat afstemming van de magnetische eigenschappen mogelijk maakt. 18

Magnetoferritin synthese kan worden uitgevoerd in een verscheidenheid van schepen, zolang ze goed afsluitbare en heeft toegangspoorten waardoor reactanten worden ingebracht (bijvoorbeeld een driehals rondbodem kolf). De reactietemperatuur moet bij 65 ° C gehandhaafd ofwel door het plaatsen van het vaartuigeen water / oliebad of met behulp van een dubbel-bemanteld vat. Hier hebben we gebruik gemaakt van een dubbele mantel elektrochemische cel setup om de synthese uit te voeren. Succesvolle synthese te garanderen, waarbij de juiste pH en het vermijden zuurstof verontreiniging van de waterige oplossingen van cruciaal belang. Metaalzoutoplossingen altijd vers worden bereid vóór te gebruiken in plaats van tevoren. Bovendien kunnen commerciële apoferritine oplossingen variëren in kwaliteit en invloed synthese resultaat (bijv., Grootte van nanodeeltjes kern gemineraliseerde). Het kan helpen om het dialyseren apoferritine oplossing in 50 mM HEPES buffer (pH 8,6) voorafgaand aan synthese om eventuele reductiemiddel door de fabrikant te verwijderen. Het is nuttig om een ​​notitie van het batchnummer van de apo-ferritine-oplossing voor de synthese te maken, dus het kan specifiek worden aangevraagd bij de fabrikant moet extra materiaal moet worden aangeschaft. Voorts moet de eiwitconcentratie van commercieel verkrijgbare apo-ferritine worden op de fles, dat kanworden gebruikt om het volume van apo-ferritine oplossing nodig voor de synthese berekenen. Als dit niet het geval is, contact op met de leverancier voor deze informatie.

Het voordeel van de geleidelijke toevoeging van metaalzouten en waterstofperoxide – zoals hier en in eerdere verslagen die – dat mineralisatie van het nanodeeltje kern zodat verschillende belastingsfactor (dwz nanodeeltjes grootte) kunnen worden bereikt worden geregeld. 33 Verder is het mogelijk om verder zuiveren magnetoferritin behulp van een magnetische scheidingskolom, bijvoorbeeld een kolom gepakt met roestvrijstalen poeder bevestigd binnen een elektromagneet. 34 Zo sterk monodisperse nanodeeltjes kernen kunnen worden geïsoleerd uit de massa magnetoferritin monster. Voor magnetische cel labeling hier gepresenteerde dit niet nodig. Een beperking van magnetoferritin synthese is de relatief lage synthese opbrengst van ongeveer 10%, en de relatief hoge kosten van commercieel apo-ferritin oplossingen. Evenwel apo-ferritine ook worden bereid uit goedkoop beschikbaar paard milt ferritine mbv neergelegde de mineralisatie-protocollen. 16

Kationisering van magnetoferritin werd bereikt door toevoeging van een molaire verhouding van 250 moleculen van DMPA en 50 moleculen per EDC negatief geladen residu (berekeningen op basis van de aminozuursequentie van paard milt ferritine). Deze overmaat reagens meer dan eiwit resulteerde in hoge kationisering rendementen, vergelijkbaar ook eerder gerapporteerde resultaten voor het kationisering van ferritine. 35 Voor MALDI-TOF analyse apoferritine en gekationiseerde apoferritine werd gebruikt vanwege de overmatige molecuulmassa van de magnetoferritin kern. Om een ​​hoge kationisatie rendementen opleveren, optimale pH is ook van cruciaal belang. EDC-gemedieerde verknoping is het meest effectief onder mild zure omstandigheden, en we vonden dat de pH 5 leverde optimale kationisatie resultaten voor magnetoferritin. Voor andere eiwitten cationization pH moet mogelijk worden geoptimaliseerd. Kationisatie bij of nabij het iso-elektrische punt van het proteïne moet worden vermeden, aangezien dit kan leiden tot ernstige neerslag.

Stamcel magnetisatie met gekationiseerd magnetoferritin was zeer efficiënt en kon worden bereikt met behulp incubatietijd ruim onder de 30 minuten. Zelfs een minuut incubatie resulteerde in een cellulair ijzergehalte van 3,6 pg, die binnen het interval bereik moeten T2 en T2 * contrast MRI beïnvloeden. 36,37 Het is ook opmerkelijk dat deze efficiënte labeling wordt bereikt met lage extracellulaire concentraties ijzer. Bijvoorbeeld eerdere studies met behulp van anionische nanodeeltjes te melden ijzergehalte van 10 pg per cel na een 30 minuten incubatieperiode met 5 mM ijzer. 38 Ter vergelijking incubatie met een gekationiseerd magnetoferritin oplossing die 0,5 uM eiwit overeenkomt met incubatie met ongeveer 0,2 mM ijzer en levert ook ongeveer 10 ug ijzer per cell na 30 minuten. We waren niet in staat om alle endocytotische blaasjes met behulp van TEM duidelijk te identificeren. Echter, eerdere studies met behulp van gekationiseerd ferritine gevonden dat internalisatie heeft plaatsgevonden binnen de eerste tien minuten van de blootstelling. 39,40 gekationiseerd ferritine kan worden gelokaliseerd in gecoate blaasjes, wat aangeeft clathrine- of caveolin-afhankelijke endocytose. Dezelfde studies dat na 30 minuten incubatie, gekationiseerde ferritine nog aanwezig op het celoppervlak, alsook in multivesiculaire lichaampjes, lijkt lysosomen.

Andere toepassingen kunnen zijn kationisering apo-ferritine kooien geladen met andere nanodeeltjes en / of functionele moleculen, zoals anti-kankergeneesmiddelen 41 of quantum dots 42. Kationisering van deze constructen ferritine kan resulteren in een snellere en efficiëntere levering van hun lading aan cellen.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was financed through the Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsored by the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC grant code EP/G036780/1).

Materials

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Fisher Scientific BPE310-1 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen Sigma Aldrich A3641 we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate  Sigma Aldrich C6768 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate  Sigma Aldrich F1543 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%) Sigma Aldrich 216763 prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate Sigma Aldrich S1804 powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron Merck Millipore SLGP033RS syringe filter
Trizma base Sigma Aldrich T1503 powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride Sigma Aldrich 31434 poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units Merck Millipore 4310 Ultracel YM-50 membrane, 12 mL volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 mL to 20 mL
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis Merck Millipore UFC801024 Ultracel-10 membrane, 4 mL volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 mL to 2 mL
ANX Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare 17-1287-04 we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column  GE Healthcare 17-1196-01 this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system GE Healthcare 28406264
sample pump P-960 GE Healthcare 18-6727-00 load sample at a flow rate of 10 mL/min
automated fraction collector Frac-950 GE Healthcare 18-6083-00
Bradford assay reagent Sigma Aldrich B6916 solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen Sigma Aldrich F4503 prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA) Sigma Aldrich 308110 CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E6383 keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) AppliChem A0689,0500 powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane Sigma Aldrich D9652 soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1000 mg/L glucose Sigma Aldrich D5546 warm in 37 °C  water bath before use
fetal bovine serum Sigma Aldrich F7524 add to stock DMEM bottle, 10 % (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution Sigma Aldrich P0781 add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration
glutamax solution Gibco 35050-087 add to stock DMEM bottle, 1 % (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor PeproTech 100-18B add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/mL
phosphate buffered saline Sigma Aldrich D8537 sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution Sigma Aldrich E5134 keep in freezer and defrost in 37 °C  water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E5134 powder; make a 2 mM solution in PBS 
bovine serum albumin Sigma Aldrich A7030 add 0.5 % (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand  Miltenyi Biotec 130-042-303 for attachment of MACS magnet
MACS MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100 % ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-102 can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter Miltenyi Biotec 130-041-407 30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66% Sigma Aldrich 7006
Titrando 907, syringe pump Metrohm 2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5 Molecular Devices Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX JEOL Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer Renishaw Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser Laser Quantum Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme Applied Biosystems Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS Malvern Instruments Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System Quantum Design Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra Siemens Used to determine longitudinal and transverse relaxivity 
Tecnai 12 BioTwin Spirit FEI Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES Agilent Used to determine iron content in cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).
  2. Decuzzi, P., Ferrari, M. The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles. Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).
  3. Cunningham, C. H., et al. Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).
  4. Song, H. T., et al. Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling. J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).
  5. Daldrup-Link, H. E., et al. Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents. Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).
  6. Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Rev. 1, (2010).
  7. Dodd, S. J., et al. Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging. Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).
  8. Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging. Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).
  9. Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).
  10. Bulte, J. W. M., et al. Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).
  11. Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).
  12. Lewin, M., et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).
  13. Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
  14. Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents. Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).
  15. Correia Carreira, ., S, , et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).
  16. Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein. Science. 257 (5069), 522-523 (1992).
  17. Klem, M. T., et al. Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage. J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).
  18. Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles. J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).
  19. Uchida, M., et al. A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent. Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).
  20. Danon, D., Skutelsk E, M. a. r. i. k. o. v. s. Y., Goldstei, L. Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces. J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).
  21. Valero, E., et al. Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes. J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).
  22. Zborowski, M., et al. Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph. Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).
  23. Ikezoe, Y., et al. Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line. Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).
  24. Uchida, M., et al. Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).
  25. Yamashita, K., et al. Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides. Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).
  26. Williams, A., Frasca, V., Coligan, J. E. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  27. Hagel, L., et al., Coligan, J. E., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. Current Protocols in Protein Science. , (2001).
  28. Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed. , 1 (2000).
  29. Correia Carreira, S., et al. Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin. Nanoscale. , (2016).
  30. Simon, G. H., et al. T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning. Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).
  31. Jubb, A. M., Allen, H. C. Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).
  32. Wang, Z. W., et al. High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4. Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).
  33. Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin). Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).
  34. Okuda, M., et al. Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures. Nanotechnology. 23 (41), 415601 (2012).
  35. Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).
  36. Billotey, C., et al. T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging. Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).
  37. Smirnov, P., et al. In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy. Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).
  38. Wilhelm, C., et al. Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells. Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).
  39. MacLean, I., Sanders, E. Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo. Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).
  40. Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts. Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).
  41. Xing, R. M., et al. Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin. J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).
  42. Wong, K. K., Mann, S. Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites. Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).

タグ

MagnetoferritinMagnetic NanoparticlesCell MagnetizationMRIMagnetic Cell SeparationApoferritinIron-cobalt PrecursorHydrogen PeroxideCationic MatrixSodium ChlorideTris Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Correia Carreira, S., Armstrong, J. P., Okuda, M., Seddon, A. M., Perriman, A. W., Schwarzacher, W. Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells. J. Vis. Exp. (118), e54785, doi:10.3791/54785 (2016).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image