표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

문화 미디어, 반 고체 한천과 바이오 필름 판, 전 문화 1. 준비 집단 및 슬라이딩 중간 준비 레녹스 브로 쓰 (LB) 2 g, 120 ° C에서 20 분 동안 100 ml의 이온 교환 수에 한천 압력솥 0.7 g을 녹인다. 실험 간의 재현성을 향상시키기 위해 소량 (50 ~ 200 ml)에 사용합니다. 즉시 멸균 후, 적어도 2 시간 동안 55 ° C의 배양기에서 증발 장소를 줄일 배지 병의 뚜껑을 닫는다. 매체 온도를 55 ° C로 단련 된 후, 실험실 멸균 후드 아래에 90mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시에 20 ㎖ 한천 LB 배지를 붓는다. 시간 경과 실험을 위해, 35mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시 당 5 ml의 한천 LB 배지를 붓는다. 즉시 주입 후 배양 접시를 닫고 서로의 상단에는 4 개 이상의 판을 적층하지 않고 한천 배지는 적어도 1 시간 동안 응고하자. 2xSG 중간 P식민지 바이오 필름에 대한 배상 영양 브로스 1.6 g, 0.2 g의 KCl, 황산 0.05 g 7H 2 O, 120 ° C에서 20 분 동안 100 ml의 이온 교환 수에 한천 압력솥 1.5 g을 녹인다. 실험 간의 재현성을 향상시키기 위해 소량 (50 ~ 200 ml)에 사용합니다. 즉시 멸균 후, 적어도 2 시간 동안 55 ° C의 배양기에서 증발을 감소시키고 용기를 배치 배지 병의 뚜껑을 닫는다. 유체 온도가 자동 조정 55 ° C로 후 1M 칼슘 멸균 0.1 ㎖의 필터를 추가 (NO 3) 2 용액 0.1 ml를 필터는 0.1 ml를 필터 1mM의 다음날에 FeSO4 용액, 0.5 ㎖의 멸균 100mM의 MnCl 2 용액을 멸균 살균 20 % 포도당 용액. 실험실 멸균 후드, 90mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시 당 20 ㎖ 한천 2 배 SG 매체를 붓는다. 시간 경과 실험을 위해, 35mm 직경의 폴리스티렌 페트리 접시 당 5 ml의 한천 LB 배지를 붓는다. 클즉시 주입 한 후 배양 접시를 전자 서로의 상단에 접시를 쌓아하지만, 이상 4 판, 그리고 한천 배지 적어도 1 시간 동안 응고 수 있습니다. 스타터 문화의 준비 참고 : B. 서브 틸리 스 (168)는, 구조적으로 설명 된 방법에 사용 된 유도체 NCIB 3610 균주는 녹색 또는 적색 형광 단백질을 생산하고 8,27 전에 설명 하였다. 균주는 -80 ° C 냉장고에 정기적으로 저장됩니다. 3 ㎖ LB 배지에서 -80 ° C 주식에서 스타터 문화를 접종 및 수평 진동 (225 RPM)와 37 ° C에서 (16 ~ 18 시간)을 밤새 품어. 야생 B.의 분리로 18 시간보다 더 오래 문화를 배양하지 마십시오 서브 틸리 집계 및 테스트 튜브에 생물막을 형성하는 대부분 쉽다. 표면에 대한 찬란 레이블 된 박테리아 균주 2. 공동 접종 확산 집단 세미 – 고체 한천 플레이트의 건조 및B.의 슬라이딩 서브 틸리 스. 진을 치고 전에 접종에 20 분 동안 슬라이딩 마른 한천 플레이트. 층류 후드에서 발견 드라이 플레이트 (도 1 참조). 참고 : 세균 득시글 거리는 슬라이딩은 반 고체 한천 배지의 건조에 따라 달라집니다. 부족 건조 편모 매개 수영의 결과로 한천 배지에 물 축적 할 수 있습니다. 득시글 거리는 부족에 장시간 건조 시간 결과. 그림 1 :.. 실험 워크 플로우 일반적인 절차는 (에서 왼쪽에서 오른쪽으로) 판, 접종 및 형광 현미경 감지 건조, 배양 배지의 준비를 포함하여, 그림에 묘사되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 공동 접종집단 및 슬라이딩에 대한 세균 배양의 600 nm에서 밤새 스타터 문화의 광학 밀도를 결정하고 B의 밀도 정규화 된 녹색과 빨간색 형광 단백질 생산 균주를 혼합 서브 틸리 NCIB 3610 또는 1.5 ml의 반응 관에서의 Δ의 노파 유도체. 예를 들어, 온화하게 변형 2. 소용돌이 (최대 속도에서 3 초)의 μL ([변형 2의 하룻밤 문화의 OD 600] / 100 * [변형 1의 하룻밤 문화의 OD 600])에 대한으로 변형 한 100 μl를 혼합 균일 한 분포. 참고 : B. 자신의 Δ의 노파 유도체가 슬라이딩에 사용되는 동안 서브 틸리 NCIB 3610 균주가 득시글 거리는을 관찰 접종한다. 스팟 미리 건조 판의 중앙에 혼합 배양 2 μL (도 1 참조) 또한, 접종 후 10 분 동안 플레이트를 건조. 37 ° C에서 접시를 품어 과잉 수분이 뚜껑에 아닌 한천 표면에 응축 할 수 있도록 수직입니다. <BR /> 참고 : B의 배양 시간 서브 틸리 득시글 거리는은 8-16 시간 사이에 일반적입니다. 일반적으로, 떼의 가장자리는 8 시간에 90mm 페트리 접시의 측면에 도달한다. 슬라이딩은 느린 과정 및 배양 적어도 16-42 시간이 필요합니다. 36 시간 후, 전방 슬라이딩는 90mm 배양 접시의 측면에 도달한다. 시간 경과 실험을 위해, 37 ° C로 설정 예열 단계 배양 챔버에서 35 mm 직경 배양 접시를 놓습니다. 페트리 접시의 뚜껑이 실험 기간에 걸쳐 제거 남아 있는지 확인합니다. 인큐베이터의 상단에 수분 형성을 회피하기 위해 40 ° C로 무대 인큐베이터의 커버를 설정합니다. 다른 초기 세포 밀도와 찬란 레이블 된 박테리아 균주 3. 공동 접종 B.의 식민지 biofilm 형성을위한 한천 플레이트의 건조 서브 틸리 스. 층류에서 커버하지 않고 식민지 바이오 필름 개발을위한 판을 건조이전에 접종을 15 분 동안 후드. 참고 :이 증가 습도, 수영 또는 득시글 거리는이 부족 건조 결과는 29 가능할 수있다. 작은 생물막 식민지에서 너무 오래 결과를 건조. 식민지 바이오 필름에 대한 10 배 희석 스타터 문화의 준비 B.의 하룻밤 스타터 문화를 생산하는 녹색과 빨간색 형광 단백질의 100 μl를 혼합 균일 분포 1.5 ml의 반응 관에서 서브 틸리 스 168 가벼운 와류. LB 배지에서 10 배 희석 시리즈를 준비합니다. 희석되지 않은 10 1 10 (2)의 스폿이 μL, 103, 생물막 유도 배지를 함유하는 플레이트에 104 희석 혼합 배양. 참고 : 6 ~ 9 생물막 식민지 식민지가 서로 동일한 거리에 분리되어 있음을 고려하여 하나의 90mm 페트리 접시에 시작할 수 있습니다. 30 ° C에서 접시를 품어 과잉 수분이 뚜껑에 응축 할 수 있도록 똑바로 세워하지 한천 표면에. 주 : B.위한 배양 시간 서브 틸리 바이오 필름은 3-1 사이의 일입니다. 일반적으로, B의 식민지 생물막 서브 틸리 2 일에 평균 크기와 복잡한 구조를 도달한다. 시간 경과 실험을 위해, 35 mm 직경의 페트리 접시의 중앙에 하나의 균액을 배치하고, 30 ℃로 설정된 예열 단계 배양 챔버에서 접시를 놓는다. 페트리 접시의 상단이 실험 기간에 걸쳐 제거 남아 있는지 확인합니다. 인큐베이터의 상단에 수분 형성을 회피하기 위해 35 ° C로 무대 인큐베이터의 커버를 설정합니다. 레이블 된 균주 4. 형광 현미경 검출 영상 장비 설명. 표면 식민지와 형광 신호를 검출하기 위해, 0.5X PlanApo 목표를 장착 한 전동 형광 스테레오 줌 현미경 (자료 표에 대한 자세한 목록 참조)를 사용하여, 두 개의 LED가콜드 – 광원 (형광 검출을위한 하나는 가시 광선에 대해 하나), 필터 세트 (629)에서 GFP (여기 40분의 470의 나노 및 배출 50분의 525 ㎚에에서) 25분의 572 ㎚에와 MRFP (여기 및 방출에 대한 / 62 ㎚) 및 높은 해상도 흑백 카메라. 멀티 채널 및 시간 경과 모듈을 포함 스테레오 줌 현미경에 사용할 적절한 소프트웨어와 이미지 수집 및 처리를 수행합니다. 시간 경과 실험을 위해, 어댑터와 스테레오 줌 현미경에 장착 된 표준 가열 단계 인큐베이터를 사용합니다. 집단 및 슬라이딩 확장의 영상 90 밀리 판의 가장 큰 가능한 영역을 캡처하는 가장 낮은 배율을 사용합니다. 반경 세균 확장과 형광을 모니터링하기위한 눈에 보이는 필드의 모서리에 접종의 기원합니다 (90mm 페트리 접시의 중간)을 설정합니다. 형광 신호의 세기에 따라 최적의 노출 시간을 조정한다. 참고 : 구조적으로 expre 들어B.에서 ssed 형광 유전자 녹색 서브 틸리 1.5 3 초의 노출 시간으로 적색 형광을 각각 사용할 수있다. 또한, 10 msec의 노출 시간은 가시광에 적합하다. 전체 생물막 콜로니의 검출을 가능 배율을 사용하여 시야의 중앙에 콜로니를 조정한다. 주 : 집단 및 확장 슬라이딩으로 최적 노출 시간은 생물막 콜로니의 형광 신호를 검출하기 위해 형광 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준에 따라 달라진다. 아래의 대표적인 결과를 들어, 녹색과 빨간색 형광은 각각 1, 3 초 노출 간격을 사용하여 검출되었다. 시간 경과 영상의 경우, 일정 노출 시간을 사용하여 특정 간격으로 이미지를 얻을 수 있습니다. 정량적 데이터 해석 ImageJ에 소프트웨어에 의해 인식되는 파일 형식으로 형광 실체 녹화 된 영상을 저장한다. 5. 날엔분석 각각 다르게 표시 형광 변형의 점유 면적을 분석하기 위해, BioVoxxel 플러그인과 확장 ImageJ에 소프트웨어에 대한 관심의 파일을 엽니 다. 옵션 만 선택하고, "오토 스케일", "모든 시리즈를 열고"여기서 "바이오 형식 가져 오기 옵션"라는 창이 나타나면 "OK"를 클릭하여 파일을 엽니 다. 참고 :이 파일은 세 가지 이미지, 현미경 (녹색, 적색 형광 밝은 필드 이미지)에서 이미지를 기록하는 데 사용되는 각 채널에 대한 하나의 스택으로 표시됩니다. "스택"- – "이미지"를 선택하여 개별 채널 이미지로 스택을 별도로 ImageJ에 제어판에서 "이미지에 스택". 참고 : 이미지가 나타나지 1/3 (녹색 채널)로 번호가 매겨집니다, 2/3 (적색 채널)과 3/3 (시야). 여기서, 시야 화상은 분석에서 제외된다. 이미지를 분석하는, 선택하는 8 비트 영상으로 각각 변환"이미지"- "유형"- "8 비트". "스케일 설정"- 화소 (2)의 점유 면적을 확인하려면, "분석"을 사용하여 이미지의 크기를 다시 설정합니다. 윈도우가 다른 스케일 옵션을 뜨면, "스케일 제거를 클릭하십시오"를 선택하여 규모를 재설정합니다. 열려있는 모든 이미지 스케일을 제거하는 옵션 "글로벌"을 확인하십시오. 배경을 제거하려면 ImageJ에 제어판에서 "타원형"도구를 사용하여 형광 영역 외부의 타원 영역 (관심 지역, ROI)을 그립니다. 배경 타원의 크기는 분석 된 모든 화상에 대해 동일한 것을 보장하기 위해, 키보드의 [t] 문자를 통해 ROI 관리자에 추가. "저장"옵션 – 배경 타원형 ROI가 "추가"를 통해 저장할 수 있습니다 어디에 투자 수익 (ROI) 관리자 창이 나타납니다. "측정"- 배경 타원형 ROI가 이미지에 표시되는 경우, "분석"을 선택하여 영역의 강도를 측정한다. 참고 : 결과다른 사람의 사이에 평균 형광 강도가 "평균"열에서 표시되는 위치 창이 나타납니다. "수학"- – "빼기"및 측정 값을 삽입 "프로세스"를 클릭하면 배경 타원형 투자 수익 (ROI)을 선택 해제하여 이미지에서 평균 배경 형광 강도의 값을 뺍니다. "조정"- – "임계 값"옵션 "영상"을 통해 이미지에 임계 값을 적용합니다. 방법 오츠와 흑백 (B & W)를 선택합니다. 은 "어두운 배경"옵션을 선택하고 "적용"을 클릭하여 임계 값을 사용한다. 참고 : 임계 값은 검은 색으로 표시됩니다 아래의 임계 값 이상의 영역이 흰색과 것을 알 수있다 이진 이미지를 이미지로 변경됩니다. "입자를 분석"옵션 -은 "분석"을 통해 임계 값 이상의 모든 것을 선택합니다. 설정에 창에서 기본 옵션을 유지하고 "S를"결과 표시 "를 유지하고ummarize 총 면적 ","결과 창에서 요약 및 표시 표시된 열에서 차지하는 영역을 표시하기 위해 "OK"선택 옵션.를 클릭하십시오. "