Produção simples e eficiente e Purificação de rato Mielina Oligodendrocyte glicoproteína de encefalomielite autoimune experimental Estudos

A esclerose múltipla é uma doença humana caracterizada pela inflamação crónica e neurodegeneração do SNC, que é pensado para ser impulsionado por uma resposta auto-imune dirigida à mielina. A perda de mielina e axônios ao longo do tempo como resultado a redução gradual da função cognitiva e motora ^1. "Encefalomielite autoimune experimental" é um termo genérico para modelos animais de doença auto-imune dirigida para a mielina do SNC. Como MS humanos, a EAE é tipicamente caracterizada pela infiltração de células imunes do sistema nervoso central e, em alguns casos, ² desmielinização. No entanto, o grau a que um determinado modelo de EAE se assemelha a MS humana, em parte, depende da espécie ou estirpe utilizada e da complexidade da resposta auto-imune anti-mielina subjacente.

auto-imunidade anti-mielina pode ser experimentalmente induzida de várias maneiras, mas o método mais comum utilizado hoje em dia é para imunizar ratinhos com um péptido curto de aminoácidos imitando o CD4 imunodominante <saté> + epítopo de célula T de uma proteína de mielina. Isto representa o requisito mínimo para induzir uma resposta patogénica. Talvez o mais comum destes é um péptido de 21 aminoácidos derivado de glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG _35-55), que é utilizado para induzir a EAE em ratinhos C57BL / 6 ^3. No entanto, para alguns fins experimentais é desejável ou mesmo necessário para imunizar com antígenos proteicos maiores e, de fato, existem várias vantagens para este mais de imunização com péptido curto. Em primeiro lugar, devido à restrição de MHC, os péptidos curtos são geralmente eficazes apenas num intervalo muito limitado de estirpes, enquanto antigénios proteicos maiores que representa tanto toda a proteína ou um domínio específico pode ser processada normalmente para a apresentação em múltiplas estirpes de ratinhos consanguíneos ou mesmo em diferentes espécies ^4. Em segundo lugar, um antigénio de proteína maior é capaz de induzir uma resposta imune mais complexo que incorpora mais tipos de linfócitos no reconhecimento do antigénio, em vez de limiting reconhecimento do antigénio às células T CD4 ^+. Por exemplo, as células B através do seu receptor de célula B (BCR) interagir directamente com todo e não processadas proteína. Nós e outros autores mostraram que as células B activadas por MOG _35-55 imunização não reconhecem proteínas MOG ^5. Uma vez que as células B foram recentemente demonstrado desempenhar um papel patogénico no MS humano ^6, modelos de EAE que incorporam as células B na patologia auto-imune são cada vez mais importante.

Apesar das vantagens da utilização de antigenes de proteínas maiores para induzir a EAE, continuam a existir algumas fontes comercialmente disponíveis para essas proteínas. Com efeito, enquanto que os péptidos curtos como MOG _35-55 pode ser sintetizada muito rapidamente e com um custo relativamente baixo, as opções para a proteína comerciais MOG são limitados e custo substancialmente mais para comprar. No entanto, existem vários vectores de expressão disponíveis para grupos de pesquisa para gerar MOG domínio extracelular (MOG _1-125) próprios. however, todos os sistemas de expressão que identificamos na literatura são baseados em tecnologias mais antigas que já foram substituídos por sistemas de expressão mais eficientes ^7. Além disso, a maioria são baseados em rato ou humana MOG ^8. Para algumas investigações de auto-imunidade em ratinhos, um antigénio com base no auto-antigénio de rato MOG é preferível. Finalmente, todas as proteínas baseados no MOG que identificámos, quer comerciais ou como vectores de expressão, são proteínas de fusão contendo aminoácidos adicionais para a base de MOG _1-125. Estes incluem um tag para a purificação e, geralmente, outras sequências, bem como, muitos dos quais com uma função não fomos capazes de identificar.

Para resolver estas limitações, geramos uma proteína de fusão romance baseado no mouse MOG domínio extracelular fundido a um tag contendo tioredoxina para combater a insolubilidade conhecida de proteína MOG ^5. A sequência de marcador contém ainda uma sequência de 6xHis para a purificação e uma protease TEV CLEAvage local que permite a remoção completa de todas as sequências de marcador, se desejado. Este é o único método que estamos cientes de gerar pura proteína MOG _1-125. Para facilitar a produção de grandes quantidades de proteína, a sequência de MOG _1-125 foi codões optimizados para a expressão bacteriana e a proteína de fusão _tag MOG foi inserida no sistema de expressão pET-32. Aqui, descrevemos detalhadamente o protocolo para produzir e purificar proteínas _tag MOG, e MOG puro _1-125, usando equipamentos não-especializados disponíveis para a maioria dos laboratórios de imunologia.