A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento
概要
armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.
Abstract
Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.
Introduction
Há mais de 70 milhões de cães de estimação nos EUA sozinho 1. Como membros da família valorizados, estes animais muitas vezes recebem corte cuidados médicos borda. Igualmente porque partilham o nosso ambiente, os cães podem fornecer insights sobre a patogênese e tratamento da doença humana 1. No entanto, se a tradução descobertas na medicina humana em tratamentos veterinários, ou vice-versa, é importante caracterizar completamente as variações das espécies, mesmo em sistemas altamente conservadas, tal como a resposta imune inata. Exemplos de diferenças entre o canino e sistema imune inato humano incluem a alta expressão de CD4 no cão neutrófilos 2; a ausência de um homólogo funcional do sensor de flagelina citoplasmática IPAF em cães e 3 a expressão de um híbrido da caspase 1/4 em carnívoros 4.
Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são um componente relativamente recentemente descoberta da imunidade inata 5. As redes são de redes de ADN proteínas, nuclear e granular liberados em resposta a uma ampla gama de estímulos inflamatórios ou infecciosos 6. Estruturas de tipo rede foram demonstradas em muitas espécies, incluindo galinhas 7, peixes, moluscos 8 9 e acoelomates 10, mas há variações de espécies. Por exemplo, os neutrófilos murino respondem mais lentamente a estímulos NETosis do que os neutrófilos humanos, e formam NET menos difusa 11. Há um grande corpo de evidências a partir de várias espécies que as redes aprisionam micróbios, e mais controversa pode ser diretamente envolvidos na eliminação de agentes patogénicos 12,13. No entanto, os componentes NET também melhorar danos nos tecidos, promover a trombose e agir como auto-antígenos 14,15. O equilíbrio entre os efeitos benéficos e deletérios da NET podem variar entre diferentes doenças e espécies diferentes, o que sugere que é importante investigar NET, tanto em espécie e condição de interesse.
Aqui nósdescrevem um protocolo simples para induzir e medir a libertação de redes por neutrófilos canino. Este método é semelhante às utilizadas para isolar os neutrófilos 16 e induzir NETosis em outras espécies, mas as condições, tais como a concentração de agonista e tempo de incubação foram optimizados para os neutrófilos canino. Um ensaio de libertação de uma rede similar quantificação do ADN foi também descrita em outras espécies, mas o método aqui apresentado é também optimizado para cães 8,17,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de libertação de ADN apresentadas é um ensaio prontamente quantificável para ADN extracelular. O método foi adaptado de técnicas semelhantes utilizadas para avaliar a formação de NET em outras espécies, mas as velocidades de centrifugação, as concentrações de agonista e os tempos de incubação foram alteradas para optimizar o processo para uso com neutrófilos canino 8,17,18. ajustes similares poderiam ser feitas para adaptar o método para outras espécies. O ensaio é simples e barato…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.
Materials
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | BD | 367835 | |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Dextran-500 | Accurate chemical and scientific corp. | AN228410 | |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher scientific | 20012043 | |
| Fetal bovine calf serum, heat inactivated | ThermoFisher scientific | 10100139 | |
| RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine | ThermoFisher scientific | 32404-014 | Should be free from phenol red |
| 96 well flat bottomed sterile polystyrene plate | Falcon | 353072 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Platelet activating factor | Sigma-Aldrich | P4904 | |
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher scientific | S7020 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | NA |
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