Recording Gamma-Band-Oszillationen in Nucleus pedunculopontinus Neurons
概要
Der Nucleus pedunculopontinus (PPN) wird in der Hirnstamm und seine Neuronen befinden sich maximal aktiviert während des Wachens und schnelle Augenbewegungen (REM) Schlaf Gehirnzustände. Diese Arbeit beschreibt die experimentellen Ansatz in vitro Gamma – Band unterschwelligen Membran Schwingung in PPN Neuronen aufzuzeichnen.
Abstract
Synaptischen efferents aus dem PPN bekannt , um die neuronale Aktivität von mehreren intralaminaren thalamischen Regionen zu modulieren (beispielsweise der zentrolateralen / parafascicular; Cl / Pf Kern). Die Aktivierung entweder des PPN oder Cl / Pf Kerne in vivo beschrieben worden , um die Erregung des Tieres und ein Inkrement in gamma – Band – Aktivität im kortikalen Elektroenzephalogramm (EEG) zu induzieren. Die zellulären Mechanismen für die Erzeugung von gamma Bandschwingungen in retikulären aktivierenden System (RAS) Neurone sind die gleichen wie diejenigen zu finden gamma Band Schwingungen in anderen Gehirnen Kerne erzeugen. Während Strom-Clamp Messungen von PPN Neuronen (von parasagittal Scheiben 9-25 Tage alte Ratten), die Verwendung von depolarisierenden quadratischen Schritte schnell spannungsabhängige Kaliumkanäle aktiviert, die PPN verhindert Neuronen von über -25 mV depolarisiert wird.
Injizieren von 1 bis 2 Sekunden lang depolarisierende Stromrampen depolarisiert allmählich PPN Membranpotential resting-Werte auf 0 mV. Jedoch Injizieren depolarisierende Rechteckimpulse erzeugt gamma-Band Oszillationen des Membranpotentials, die in der Amplitude kleiner zeigten im Vergleich zu den durch Rampen erzeugten Schwingungen. Alle Experimente wurden in Gegenwart von spannungsgesteuerten Natriumkanäle und schnelle synaptische Rezeptoren-Blocker durchgeführt. Es hat sich gezeigt, dass die Aktivierung von Hochschwellenspannungsabhängigen Calciumkanälen gamma-band oszillatorischen Aktivität in PPN Neuronen zugrundeliegen. Spezifische methodische und pharmakologische Interventionen sind hier beschrieben, die notwendigen Werkzeuge zur Verfügung stellt PPN in vitro unterschwelligen Gamma – Band Schwingung zu induzieren und aufrechtzuerhalten.
Introduction
PPN Kern ist anatomisch in der Schwanz mesencephalen tegmentum enthalten. Die PPN ist eine Schlüsselkomponente der RAS 1. Die PPN beteiligt sich an der Aufrechterhaltung von Verhaltens aktivierten Zustände (dh dem Aufwachen, REM – Schlaf) 2. Elektrische Stimulation des PPN in vivo induziert schnelle Oszillation (20 bis 40 Hz) in dem kortikalen EEG 3, während bilaterale PPN Läsionen in Ratten reduziert oder eliminiert REM sleep 4. Während eine Mehrheit der PPN Neuronen Aktionspotenziale feuern bei Beta / Gamma-Band – Frequenz (20 – 80 Hz), einige Neuronen niedrige Raten von spontanen Feuer präsentiert (<10 Hz) 5. Darüber hinaus scheint die PPN in anderen Aspekten des Verhaltens beteiligt zu sein wie Motivation und Aufmerksamkeit 6. Direkte Hochfrequenz (40 – 60 Hz) 7 elektrische Stimulation von PPN Kern in decerebrate Tiere können die Fortbewegung zu fördern. In den letzten Jahren hat sich die tiefe Hirnstimulation (DBS) von PPN verwendet, um Patienten zu behandeln, Leiden from Erkrankungen mit Gang Defizite wie Parkinson-Krankheit (PD) 8.
Frühere Berichte zeigten , dass fast alle PPN Neuronen Aktionspotentiale bei Gamma – Band – Frequenz feuern kann , wenn 9 mit quadratischen Stromimpulse depolarisiert. Wegen der drastischen Aktivierung von spannungsgesteuerten Kaliumkanäle während der Rechteckimpulse Depolarisationen bis zu oder unter -25 mV. Als Folge wurden Tetrodotoxin 10 nach der Blockierung Aktionspotentiale Generation mit keine belastbaren Gamma – Oszillationen beobachtet. In dem Bemühen, dieses Problem zu umgehen, 1 – 2 sec lang Stromrampen depolarisierende wurden verwendet. Ramps depolarisiert allmählich das Membranpotential von Werten von bis zu 0 mV ruhen, während sie teilweise spannungsgesteuerte Kanäle Kalium inaktivieren. Klare gamma Band Membran Oszillationen waren evident in der Spannungsabhängigkeit Fenster der hohen Schwellencalciumkanäle (dh zwischen -25 mV und -0 mV) 10. Abschließend Gamma-Band activity wurde müssen in PPN Neuronen 9, und beide P / Q- und N-Typ – spannungsabhängigen Calciumkanälen beobachtet , um aktiviert zu werden , um Gammabandschwingungen im PPN 10 erzeugen.
Eine Reihe von Studien bestimmt die Position des hohen Schwellencalciumkanäle in PPN Neuronen. Injizieren der Kombination von Farbstoffen, ratiometrisch Fluoreszenzabbildung zeigte Calciumtransienten durch spannungsabhängige Calciumkanäle , die in unterschiedlichen Dendriten aktiviert werden , wenn 11 unter Verwendung von Stromrampen depolarisiert.
Intrinsischen Eigenschaften von PPN Neuronen wurden vorgeschlagen im Wachzustand und REM-Schlaf gleichzeitige Aktivierung dieser Zellen zu ermöglichen, so dass der Hochfrequenz neuronaler Aktivität zwischen RAS und thalamokortikalen Schleifen induziert. Solche langreichende Interaktion gilt als die Welt um uns die Beurteilung auf einer kontinuierlichen Basis 12 einen Gehirnzustand der Lage , zuverlässig zu unterstützen. Hier beschreiben wir das Experimental notwendigen Bedingungen zu erzeugen , und Gamma – Band Schwingung in PPN – Zellen in vitro aufrechtzuerhalten. Dieses Protokoll wurde bisher nicht beschrieben, und würde eine Anzahl von Gruppen Hilfe Eigenschaften intrinsischen Membranaktivität vermittelnden gamma-Bande bei anderen Gehirnbereichen zu untersuchen. Außerdem könnte von der aktuellen Schritte zum falschen Schluss führen, dass Gamma-Band-Aktivität kann nicht in diesen Zellen erzeugt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
PPN Neuronen intrinsische Eigenschaften, die sie während der Aktionspotentiale in vivo – Aufnahmen von Tieren bei Beta / Gamma – Band – Frequenzen zu feuern lassen , die wach sind oder während des REM – Schlaf, aber nicht während der langsamen Welle Schlaf 2,3,5,13-17. Andere Autoren haben gezeigt, dass brainstem Querschnitten erhalten bei mehreren vorderen Ebenen zeigte als PPN Gamma Frequenzen während EEG-Aufzeichnungen reduziert. Wenn jedoch brainstem Läsionen posterior, wo dieser Kern befind…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by core facilities of the Center for Translational Neuroscience supported by NIH award P20 GM103425 and P30 GM110702 to Dr. Garcia-Rill. This work was also supported by grants from FONCYT-Agencia Nacional de Promociòn Cientìfica y Tecnològica; BID 1728 OC.AR. PICT-2012-1769 and UBACYT 2014-2017 #20120130101305BA (to Dr. Urbano).
Materials
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | C12H22O11, molecular weight = 342.30 |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | NaHCO3, molecular weight = 84.01 |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | KCl, molecular weight = 74.55 |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | MgCl2 · 6H2O, molecular weight = 203.30 |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | CaCl2 · 2H2O, molecular weight =147.02 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | C6H12O6, molecular weight = 180.16 |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | C6H8O6, molecular weight =176.12 |
| Sodium Chloride | Acros Organics | 327300025 | NaCl, molecular weight = 58.44 |
| Potassium Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | C6H11KO7, molecular weight = 234.25 |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma-Aldrich | P1937 | C4H10N3O5P · 2C4H11NO3, molecular weight = 453.38 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | C8H18N2O4S, molecular weight = 238.30 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | [-CH2OCH2CH2N(CH2CO2H)2]2, molecular weight = 380.40 |
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma-Aldrich | A9187 | C10H16N5O13P3 · xMg2+, molecular weight = 507.18 |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | C10H16N5O14P3 · xNa+, molecular weight = 523.18 |
| Tetrodotoxin citrate | Alomone Labs | T-550 | C11H17N3O8, molecular weight = 319.27 |
| DL-2-Amino-5-Phosphonovaleric Acid | Sigma-Aldrich | A5282 | C5H12NO5P, molecular weight = 197.13 |
| CNQX disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | C239 | C9H2N4Na2O4 · xH2O, molecular weight = 276.12 |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | C21H22N2O2, molecular weight = 334.41 |
| Mecamylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | M9020 | C11H21N · HCl, molecular weight = 203.75 |
| Gabazine (SR-95531) | Sigma-Aldrich | S106 | C15H18BrN3O3, molecular weight = 368.23 |
| Ketamine hydrochloride | Mylan | 67457-001-00 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| Pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| Pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| Pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200 S | |
| Refrigeration system | Vibratome Instruments | 900R | |
| Equipment | |||
| microscope | Nikon | Eclipse E600FN | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | ROE-200 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| A/D converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| heater | Warner Instruments | TC-324B | |
| pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S 7519-20 | |
| pump cartridge | Cole-Parmer | Masterflex 7519-85 | |
| pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| camera | Q-Imaging | RET-200R-F-M-12-C |
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