Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet<em> Nematostella vectensis</em
概要
Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.
Abstract
Cnidaires, et plus particulièrement Hydra, ont été les premiers animaux présentés pour régénérer des structures endommagées ou coupées, et en fait de telles études sans doute lancé l' enquête biologique moderne à travers le travail de Trembley il y a plus de 250 ans. Actuellement , l'étude de la régénération a vu une résurgence en utilisant les deux organismes régénérateurs "classiques", comme l'hydre, planaria et Urodèles, ainsi qu'un éventail d'espèces couvrant la gamme des métazoaires d'élargissement, des éponges par les mammifères. Outre son intérêt intrinsèque comme un phénomène biologique, de comprendre comment la régénération fonctionne dans une variété d'espèces va nous informer si les processus de régénération ont des caractéristiques et / ou des espèces communes ou des mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques au contexte. La starlette anémone de mer, Nematostella vectensis, est un organisme modèle émergent pour la régénération. Comme Hydra, Nematostella est membre du phylum antique, cnidaires, mais à l' intérieur til anthozoa de classe, un clade jumeau du hydrozoaires qui est évolutivement plus basale. Ainsi , les aspects de la régénération dans Nematostella sera intéressant de comparer et contraster avec ceux d'Hydra et d' autres cnidaires. Dans cet article, nous présentons une méthode pour bisect, observer et classer la régénération de la fin aboral de l'adulte Nematostella, qui est appelé le physa. Le physa subit naturellement la fission comme un moyen de reproduction asexuée, et soit la fission naturelle ou amputation manuelle du physa déclenche re-croissance et la réforme des morphologies complexes. Ici , nous avons codifié ces changements morphologiques simples dans un système de stadification Nematostella Régénération (la NRSS). Nous utilisons la NRSS pour tester les effets de la chloroquine, un inhibiteur de la fonction lysosomale qui bloque autophagy. Les résultats montrent que la régénération des structures polype, en particulier les mésos, est anormal lorsque l'autophagie est inhibée.
Introduction
L'observation de la régénération en une seule hydra a été l'événement séminal dans l'avènement de la biologie comme une science expérimentale 1,2. La régénération reste un phénomène de extraordinairement large appel au biologiste et laïc semblables. Le potentiel pour les biologistes du développement, des cliniciens, des chercheurs en sciences biomédicales et des ingénieurs de tissus pour comprendre et surmonter les limites de la régénération humaine rend la régénération de la biologie plus intrinsèquement intéressante.
Maintenant, avec l'utilisation des nouvelles technologies telles que le séquençage du génome et le gain et la perte d'outils de fonction, le champ est prêt à taquiner les mécanismes en dehors de régénération et de comprendre finalement comment diverses espèces peuvent se régénérer tandis que d'autres ne peuvent pas. Le degré de similitude dans les réponses moléculaires, cellulaires et morphologiques reste à élucider, mais jusqu'à présent, il semble que les réponses de base chez les animaux qui peuvent se régénérer est plus semblable que aurait été imagined seulement il y a 3 ans.
Cnidaires en particulier, sont facile à régénérer la quasi-totalité de leurs parties du corps au milieu d'un large éventail de la diversité morphologique. Du polype solitaire d'eau douce, Hydra ainsi que les petits polypes marins qui construisent d'immenses récifs coralliens, les siphonophores coloniales complexes, comme l'Homme-O-War portugais, la régénération est souvent un mode de reproduction, en plus d'un mécanisme de la réparation ou la réforme des parties du corps endommagées ou perdues résultant de blessures et de la prédation. Que les diverses espèces de cnidaires utilisent des mécanismes similaires ou différents pour la régénération est une question fondamentalement intéressante 4-6.
Nous, et d' autres ont mis au point l'anthozoaire, Nematostella vectensis comme un modèle pour la régénération 7-17. Nous avons récemment développé un système de mise en scène pour décrire la régénération d'un corps entier d'un morceau morphologiquement uniforme du tissu bissectrice des Aboral extrémité du polype 10. Alors que les polypes Nematostella peuvent se régénérer quand bissectrice à tous les niveaux, nous avons choisi de couper les adultes à une position aboral dans la région la plus morphologiquement simple, la physe, en partie parce que cela est proche du plan normal de la fission naturelle et asexuée 18, et aussi parce qu'il permet l'observation et des analyses moléculaires de la façon dont un corps entier est remonté à partir des composants les plus simples morphologiques.
Le système de stadification Nematostella Régénération (NRSS) fournit un ensemble relativement simple de repères morphologiques qui pourraient être utilisés pour marquer les progrès de tout aspect de la régénération par une physa amputée, dans des conditions normales de culture ou expérimentalement perturbé des situations telles que les petits traitements de molécules, les manipulations génétiques ou l'altération de l'environnement. Comme prévu, le NRSS est de plus adopté comme un échafaudage morphologique sur lequel les événements cellulaires et moléculaires de la régénération peuvent être référencées10.
Enfin , notre méthode de coupe produit un trou béant de plusieurs ordres de grandeur supérieure à la ponction de point de broches utilisé dans une étude récente 17, mais les deux plaies à guérir dans environ 6 heures. Documenter les phases visuellement saisissantes et distinctes de fermeture de la plaie devrait suggérer des approches expérimentales pour expliquer l'apparente indépendance de la taille d'une blessure et le temps qu'il faut pour fermer. Ainsi, une compréhension visuelle plus profonde du processus d'amputation aboral, fourni par ce protocole, aidera d' autres investigations dans ce système de régénération de modèle et d' élargir l'application de ce système de mise en scène en utilisant Nematostella vectensis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilisation de Nematostella comme un modèle de cicatrisation des plaies et la régénération devient de plus en plus populaires. Par conséquent, il est important d'être en mesure de visualiser les modèles morphologiques d'un protocole particulier avant les analyses cellulaires et moléculaires efficaces peuvent être affectées et comparées. Nematostella ont un haut degré de régénération "flexibilité", être en mesure de réformer presque toute structure manquante amputée …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un New York Stem Cell Science (NYSTEM C028107) Subvention à GHT.
Materials
| Nematostella vectensis, adults | Marine Biological Lab (MBL) | non-profit supplier | |
| Glass Culture Dish, 250 ml | Carolina Biological Supply | 741004 | 250 ml |
| Glass Culture Dish, 1,500 ml | Carolina Biological Supply | 741006 | 1,500 ml |
| Polyethylene transfer pipette, 5ml | USA Scientific | 1022-2500 | narrow bore, graduated |
| Polyethylene transfer pipet, tapered | Samco | 202-205 | cut off 1 inch of tip to make wide bore |
| Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co. Ltd | no. 10 | blade should be curved |
| #5 Dumont Fine point tweezers | Roboz | RS5045 | alternative suppliers available |
| Pyrex petri dish, 100 mm diameter | Corning | 3160 | can substitute other glass petri plates |
| Sterile 6 well plate | Corning Falcon | 353046 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 12 well plate | Nunc | 150628 | or similar from other manufacturer |
| Sterile 24 well plate | Cellstar, Greiner bio-one | 662-160 | or similar from other manufacturer |
| Brine shrimp hathery kit | San Francisco Bay; drsfostersmith.com | CD-154005 | option for growing brine shrimp |
| pyrex baking dish | common in grocery stores | option for growing brine shrimp | |
| artificial seawater mix 50 gal or more | Instant Ocean; drsfoster-smith.com | CD-116528 | others brands may suffice |
| Plastic tub for stock ASW preparation | various | common 25 gallon plastic trash can OK | |
| Polypropylene Carboy | Carolina Biological Supply | 716391 | For working stock of ASW @ 12 ppt |
| Beaker, Graduated, 4,000ml | PhytoTechnology Laboratories | B199 | For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt |
| Stereomicroscope and light source | various | with continuous 1 – 40x magnification |
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