마우스에서 가속 죽상 경화증의 유도: "와이어 부상" 모델
概要
이 연구는 마우스에 있는 가속된 죽상 경화증의 유도를 위한 침략적인 절차를 기술합니다. 전기 또는 극저온 유도 된 상해를 사용하는 다른 방법에 비해, 기계적 으로 인한 상해는 재변 치료 후 restenosis의 인간의 상태를 모방하고 관련된 분자 메커니즘의 연구에 이상적입니다.
Abstract
죽상 동맥 경화증은 동맥 벽에서 발전하는 증식 섬유 염증 성 질환으로 혈류 가 부족하거나 혈류 부족을 유발합니다. 더욱이, 결함이 있는 혈관 벽의 파열에 의해, 동맥 경화증은 심근 경색 또는 치기의 주요 원인 및 죽음의 가장 빈번한 원인을 나타내는 폐색 혈전 형성을 유도합니다. 심혈관 분야의 진보에도 불구하고, 많은 질문이 답을 찾지 못하고 있으며, 죽상 동맥 경화증 과 그 효과 동안 분자 메커니즘에 대한 이해를 향상시키기 위해서는 추가적인 기본 연구가 필수적입니다. 제한된 임상 연구로 인해 스텐트 이식 후 신자극성 형성, 풍선 혈관 성형술 또는 종말발성술과 같은 죽상 경화 상태를 재현하는 대표적인 동물 모델에 대한 필요성이 있습니다. 마우스는 많은 장점을 제시하고 분자 프로세스를 공부하기 위한 가장 빈번한 모형이기 때문에, 현재 연구 결과는 또한 재변절차 후에 동맥에 있는 neointima 대형의 인간적인 상태를 대표하는 철부 상해 모형으로 알려져 있는 내피성 반출의 침략적인 절차를 제안합니다.
Introduction
죽상 경화증은 심근 경색 또는 치기와 같은 심장 혈관 사건의 근본적인 주요 병리학입니다. 급성 심혈관 증후군을 유발하는 주요 메커니즘은 플라크 파열, 피상침식 및 혈전 형성입니다. 플라크 발달에 연결된 여러 임상 상황이 있습니다: 토착 죽상 경화성 플라크, 종말 이후의 restenosis, 및 스텐트 이식 없이 풍선 혈관 성형술 후 의 석면1. 동맥 손상 후, 염증 과정의억제(2,3) 및 내피구의 회수는 추가 합병증을 방지하기 위해 필수적이다1. 임상 연구는 윤리적 고려 사항, 비용 및 기본 메커니즘에 대한 지식부족으로 인해 조직 및 혈액 샘플로 제한됩니다. 이러한 이유로, 임상 상태를 재현할 수 있는 동물 모델4-6에서분자 메커니즘을 연구할 필요가 있다. 죽상 동맥 경화증의 맥락에서 가속 된 네오인티마 형성의 우리의 모델은 작은 동물7-11에서이러한 모델의 구현에 대한 수년간의 경험의 결과입니다. 마우스 모델은 취급의 용이성, 동물 구매 및 관리와 관련된 저렴한 비용으로 인해 큰 동물 그룹을 가질 수있는 능력, 다양한 형질 전환 및 녹아웃 균주의 가용성으로 인해 연구를위한 가장 매력적인 모델입니다.
마우스 모델의 주요 단점은 동맥 경화성 질환(경동맥, 대동맥 및 대퇴동맥)을 받는 주요 동맥의 작은 크기로, 혈관을 조작하고 침습적으로 동맥경화성 플라크를 유도하기 위해 자격을 갖춘 외과 적 전문 지식과 기술을 필요로 한다. 따라서, 이 논문에서 제안된 종말또는 스텐트 이식 후 의정작용의 맥락에서, 가속된 네오인티마 형성의 모델은 관심 있는 인력에 대한 도입을 용이하게 하기 위한 단계별 지침 및 제안으로 제시된다. 또 다른 단점은 비하가 정상적인 동맥 벽에 이루어지므로, 따라서, 신-인티마 형성은 임상 상황에 비해 온건할 것이라는 것이다. 높은 수준의 혈장 콜레스테롤은 아폴리포프로틴 E녹아웃(Apoe-/-)-/-높은 지방 식단으로 공급되는 마우스는 신친티마 형성에 필요한 적절한 염증성 환경을 조성한다.
수술은 스테레오 현미경으로 수행됩니다. 경동맥은 복부 자궁 경부 부위의 중앙 분리에 의해 노출됩니다. 경동맥 위에 해부학적 구조가 수술 후 염증을 줄이기 위해 최소한으로 조작됩니다. 경동맥 분면이 노출됩니다. 가속 된 neointima 형성을 유도하기 위해, 내부 및 외부 경동맥은 혈류 중단 및 후속 일반적인 경동맥 부인을 위해 준비됩니다. 결론적으로, 이 방법은 동물 수술 경험이 부족한 인력에 의해 배울 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서는 동물 수술 경험이 부족한 인력에 의해서도 와이어 부상 절차를 수행하는 유용한 팁을 제공합니다. 외부 경동맥의 절개와 와이어 삽입이라는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 외부 경동맥의 절개는 충분한 잔류 물질을 보장하기 위해, 분기로부터 가능한 한 수행되어야한다(도 1C). 절개는 전체 선박을 절단할 위험이 있기 때문에 너무 커서는 안됩니다. 두 번째 중요한 단계는 혈류가 효율적으로 중단되지 않으면 동맥 절제술 과 가이드 와이어의 삽입 중에 출혈의 위험이 높다. 더욱이, 내피 성약이 일어나지 않거나 가이드 와이어가 루멘 용기에 제대로 도입되지 않으면 동맥 파열이 가능할 수 있다. 이를 방지하기 위해 가이드 와이어의 표면은 작동 전에 신중하게 연마되어야 합니다.
프로토콜을 최적화하기 위해 마우스 헤드가 있는 수술대의 위치가 적절한 가이드 와이어 조작에 대한 더 나은 보기, 접근성 및 제어를 보장합니다. 또한 재현성을 높이기 위해 모든 연구에서 동일한 가이드 와이어를 사용하십시오. 와이어 크기는 변하지 않기 때문에 연구에 포함된 모든 마우스에 대해 동일한 성별, 연령 및 체중을 사용하여 마우스 간의 가능한 모든 차이를 고려하고 제거하는 것이 중요합니다. 그 후, 에반스 블루 염색은 외과 의사가 부인의 효율성을 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 적절한 장비의 존재는 절차의 성공을위한 전제 조건입니다. 10X 스테레오현미경은 이 절차를 수행하는 데 필수적입니다. 가이드 와이어의 적절한 준비 (예 : 연마)가 중요합니다. 따라서 가이드 와이어 준비를 가능한 전문 기술 인력에 의해 수행하는 것이 좋습니다.
이 프로토콜에는 많은 문제 해결 단계가 있습니다. 분기 부근의 외부 경동맥을 절개하면, 분기 부근의 엑스터를 조심스럽게 묶기 때문에 출혈이 발생하지 않도록 하십시오. 절단 하는 동안, 외부 경 동맥을 볼 수 없습니다. 따라서 실크 봉합사의 수준에서 분기를 고려하십시오. 실크 봉합사가 사라지면 섹션을 수집합니다. 외부 경동맥의 절개가 너무 크고 혈관이 파열되면 경동맥 과 내부 경동맥으로의 혈류가 효과적으로 중단되고 집게를 사용하여 혈관의 개구부를 찾으려고 노력한다. 가이드 와이어를 도입하고 비하를 수행 한 후, 분기 근처 선박을 바인딩합니다. 절단 하는 동안 봉합사에서 실크가 사라지기 시작할 때 수집하기 시작합니다. 가이드 와이어로 반증하는 동안 동맥 파열이 발생하는 경우 가이드 와이어가 제대로 연마되었는지 현미경으로 확인하십시오.
임상 상황에 와이어 상해 모형의 유사성에도 불구하고, 많은 단은 마우스에 있는 토착 동맥 경화증에 집중됩니다, 또는 작은 동물 수술을 능력을 발휘할 수 있는 훈련된 인력의 부족 때문에 쥐 또는 토끼에 있는 풍선 혈관 성형술과 같은 침략적인 동맥 경화증 유도를 선택합니다. 토끼 /쥐를 사용 하 여 혜택에도 불구 하 고, 예를 들어 소형화 된 장비에 대 한 필요, 쥐 모델 도 토끼 모델 다양 한 녹아웃 균주를 제공, 네오인 티마 성장 및 스텐트 혈전증에 관련 된 분자 메커니즘을 공부 의 관점에서.
마우스에서 스텐트 내 레스텐소를 연구하기 위한 기존 모델은 어렵고, 높은 수술 능력을 필요로 하며, 출혈이나 마비와 같은 합병증의 위험이 높습니다. 예를 들어, 대퇴동맥을 통한 흉부 대동맥내로의 기계적 상해 또는 스텐트 이식은 높은 사망률(35%)을 동반한다. 뒷다리 마비 또는 출혈13-15로인해. 우리는 또한 마우스(16)의경동맥에 스텐트 이식을 설명합니다. 절차는 비슷합니다. 그러나, 분석을 위한 조직 처리는 복잡하고 모든실험실(16)에는제공되지 않는다. 경동맥은 수술 절차뿐만 아니라 초음파 이미징과 같은 기존 이미징 방법에 대해서도 직접 접근 할 수 있습니다. 마우스내 경동맥의 다른 상해 유도는 전기장치(17)를사용하여 수행될 수 있다. 이 방법은 수행하기 쉽고 높은 재현성을 보장합니다. 그러나, 그것은 기계적 상해와 동일하지 않은 모든 선박 층에서 부상을 유도한다. 풍선 응용 프로그램은 임상 사례에 따라 혈관 직경조정과 같은 이점이 있으며 병리학적 결과에 강한 영향을 미칩니다. 마우스 풍선을 사용할 수 있지만, 그들은 매우 비싸므로 널리 사용되지 않습니다. 대신, 와이어 부상은 스텐트 협착증을 모방한 확립된 방법입니다.
기상경화성 배경이 있지만, 반증은 정상적인 동맥 벽에서 수행됩니다. 따라서, 네오인티마 형성은 임상 상황에 비해 중등도가 될 것이다. 전임상 모델의 높은 수는 어떤 모델도 인간에서 병리생리학으로 이어지는 세포 및 분자 메커니즘의 전체를 발견하는 데 필요한 모든 기준을 충족하지 않는다는 것을 보여줍니다(표 2참조).
와이어-상해 절차를 수행한 후, 다른 생물학적 및 분자 분석은 세포, 단백질, mRNA, microRNAs, 유전자 또는 기타 바이오마커를 식별하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 죽상 경화증에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 치료 적 표적으로 사용될 수 있으며, 특히 혈관 손상 후 신자극성 형성을 위한 것이다. 가능한 경우, 플라크 성장은 고주파 초음파 또는 기타 고해상도 이미징 기술을 사용하여 모니터링될 수 있습니다. 더욱이, 이 기술을 마스터하면 운영자가 칼라 배치, 부분 결찰 또는 스텐트 이식과 같은 다른 침습성 죽상 경화증 유도 모델에 프로토콜을 조정할 수있는 기회를 제공 할 것입니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 임상 연구 IZKF Aachen에 대한 학제 간 센터에 의해 지원되었다 (E.A.L.에 주니어 연구 그룹) RWTH 아헨 대학에서 의학 학부 내에서. 우리는 또한 면역 히스토케토화학 염색에 도움을 준 로야 솔탄 부인에게 감사드립니다.
Materials
| Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
| Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
| Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
| Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
| Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
| Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
| Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
| Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
| Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
| Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
| Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
| section thickness 100 µm, | |||
| polytetrafluorethylene catheter | |||
| PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
| 7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
| Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
| Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
| 14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
| Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |
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