אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון.
קלטות אלקטרו מתוך פרוסות חוט שדרה הוכיחו להיות טכניקת ערך לחקור מגוון רחב של שאלות, מן הסלולר מאפייני רשת. אנחנו מראים איך להכין פרוסות קיימא אלכסוניות של חוט השדרה של עכברים צעירים (P2 – P11). בהכנה זו, motoneurons לשמור האקסונים שלהם יוצאים מן שורשי הגחון של חוט השדרה. גירוי של אקסונים אלה מעורר גב הפצת פוטנציאל פעולה פולש somas motoneuron ומרגשים בטוחות motoneuron בתוך חוט השדרה. הקלטה של פוטנציאל פעולה antidromic היא דרך מיידית, מוחלטת ואלגנטית לאפיין זהות motoneuron, אשר עולה שיטות זיהוי אחרות. יתר על כן, מגרה בטוחה motoneuron היא דרך פשוטה ואמינה כדי להלהיב את המטרות בטחונות של motoneurons בתוך חוט השדרה, כגון motoneurons אחר או Renshaw תאים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הקלטות antidromic מן motoneuron somas וכן עירור התא Renshaw, הנובע גירוי שורש הגחון.
מבחינה היסטורית, הקלטות motoneuron באמצעות אלקטרודה חדה נערכו in vivo על בעלי חיים גדולים כגון חתולים או חולדות 1 או על חוט השדרה כולו מבודד בעכברים 2. הופעה של טכניקת הקלטת תיקון- clamp במהלך 1980, קרא גישה ישירה אל motoneuron somas איטום צריך להיות מושגת תחת הנחיה חזותית. לפיכך, הכנת פרוסת חוט השדרה הושגה בקלות מאז תחילת שנות 1990 3. עם זאת, להכנת פרוסה מוקדם לעתים קרובות לא מאפשרת הגירוי של שורשי הגחון. למיטב ידיעתנו, רק שני מחקרים דיווחו גירוי מוצלח של שורשי הגחון פרוסים רוחבי, ואף אחד הושג מעכברי 4,5.
במאמר זה אנו מציגים טכניקה כדי להשיג פרוסות חוט השדרה קיימא של עכברים בילוד (P2 – P11) שבו הבריכה motoneuron שומרת אקסונים היוצאים שורש הגחון שלה. לפרוקגירוי שורש RAL מפעיל פוטנציאל פעולת antidromic בחזרה somas על ברכת motoneuron יציאה מאותו שורש הגחון. זה גם מלהיב את המטרות בטחונות motoneuron, motoneurons האחר 6-10 ותאי Renshaw 11-13. מאז רק motoneurons לשלוח האקסונים שלהם למטה השורשים הגחון, אנו משתמשים הקלטה של פוטנציאל פעולה antidromic כדרך פשוטה סופי physiologicaly לזהות motoneurons 10.
בנוסף לשימוש פוטנציאלי הלא כלול או מטעה קריטריונים אלקטרו וצורני כדי לוודא את זהותו motoneuron, מחקרים שנעשו לאחרונה על motoneurons חוט השדרה הסתמך גם על 16 מייגע זמן רב פוסט הוק stainings. זיהוי כאלה בדרך כלל מבוצע רק על מדגם של התאים המוקלטים. באסטרטגיות זיהוי אחרים מסתמכים על קווי עכבר שבה motoneurons להביע הקרינה אנדוגני <sup> 17-19. עם זאת, באמצעות סמנים מקודדים גנטי עלול להיות קשה בגיל צעיר כאשר ביטוי סמן עדיין משתנה או אם המחקר כבר דורש באמצעות קו עכבר מהונדס. לחלופין, הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic יכולות להתבצע באופן שגרתי על כל העכברים מתחיל הקלטת תא. מבצעי ניסוי עובדים על הכנות חוט שדרה שלמות של החתול, חולדה ועכבר, משתמשים באופן מהימן טכניקות זיהוי כאלה מאז 1950 1,2,20,21. בתנאים אופטימליים, הצלחנו לעורר פוטנציאל פעולה antidromic מן כמעט כל motoneurons מוקלט.
יתר על כן, גירוי שורש גחון יכול לשמש כדי להלהיב motoneurons האחר מהימן 22,23 או המטרות שלהם. 10,24,25 התאים Renshaw. אנו מציגים כאן יישומים של גירוי שורש הגחון בצורת הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic מ motoneuron somas, וכן עירור של תאי רנשו.
חיתוך אלכסוני של חוט השדרה הוא חשוב שכן הוא מאפשר גירוי חד-צדדי של ברכות motoneuron ותאי Renshaw בכל מגזר בחוליות יחיד באופן אמין, מקיף וספציפי. יתר על כן, היא מאפשרת זיהוי מהיר, אלגנטי ולא מעורפל של motoneurons מוקלט. לאחר מכן, אנו נדגיש את היתרונות של טכניקה זו לעומת שיטות כנות פרוס…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים מרין מנואל ואוליביה גולדמן-Szwajkajzer על עזרתם לוקח את התצלומים. המחברים מודים גם ארג'ון Masukar וטוביאס בוק להגהה את כתב היד. תומך פיננסי נמסרו על ידי Nationale Agence לשפוך la משוכלל ונדיר (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), ה- NIH-NINDS (R01NS077863), קרן תיירי לטראן (פרויקט OHEX), האגודה הצרפתית מיופתיה ( מספר מענק 16026) ומחיר היעד ALS הם הודו בהכרת תודה. פליקס לירוי היה הנמען של "דוקטור Contrat" מן אקול נורמל סופרייר, Cachan.
Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
KCl | Sigma | P3911 | |
NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
sucrose | Sigma | S9378 | |
NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
glucose | Sigma | G5767 | |
ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
K-gluconate | Sigma | P1847 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
Agar | Sigma | A9799 | |
QX-314 | Alomone | Q150 | |
Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
CsOH | Sigma | 232041 | |
Na-GTP | Sigma | 51120 | |
gluconic acid | Sigma | G1951 | |
Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
KOH | Sigma | P5958 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 |