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生物工学

의 응용 프로그램<em> 생체</em> 조직 평가를위한 쥐 앞정 전방의 기능 테스트는 골격근 수리 엔지니어링

Published: October 07, 2016
doi:
10.3791/54487
, , ,
1病理学科,University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering,University of Virginia, 3Department of Orthopaedic Surgery,University of Virginia

概要

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Abstract

골격 근육, 영구적 인 기능 및 / 또는 화장품 적자 (예를 들어, 외상, 질병 및 각종 선천성 유전 및 인수 조건에 따른 체적 근육 손실 (VML)이 매우 일반적이다. 조직 공학 및 재생 의학 기술이 엄청난이의 재생 능력에도 불구하고 전위 치료 솔루션을 제공한다. 그러나, 적절한 기능적 수단의 길이 평가와 함께 생물학적으로 중요한 동물 모델의 이용이 VML 같은 상처 치료를위한 향상된 재생 치료제의 개발에 중요하다. 이와 관련하여, 시판 근육 레버 시스템 길이 장력 힘 골격근 속도 파라미터를 측정하는데 사용될 수있다. 우리의 전방 crural 구획의 활성화에 응답하여 생체 내 힘 생성을 측정하기 위해 고전력, 바이 – 페이즈 자극기와 관련하여, 본 시스템을 사용 쥐의 뒷다리는. 우리는 previ있다ously 경골근 (TA) 근육에 VML 부상의 기능에 미치는 영향뿐만 아니라 우리의 조직 ​​설계 근육 수리 (TEMR) 기술로 부상 TA 근육의 치료 다음과 같은 기능 회복의 정도를 평가하기 위해이 장비를 사용했다. 이러한 연구를 들면, 마취 래트 왼발 안전하게 서보 모터에 연결된 발판에 고정되고, 상기 공통 비골 신경 근육 위축 및 발의 배굴을 유도하기 위해 두 경피적 바늘 전극에 의해 자극된다. 비골 신경 자극 – 유도 된 근육 수축 피크 파상풍 힘의 정확한 결정을 가능하게 힘을 생산 궁극적 고원 있도록 자극 주파수 (Hz에서 1-200)의 범위에 걸쳐 측정된다. VML 부상의 정도뿐만 아니라 치료 다음 기능 회복의 정도의 평가에 더하여,이 방법은 쉽게 근육 생리학 및 병리학의 다양한 양상을 연구하기 위해 적용될 수있다. 이러한 접근 웃음근육 수리 및 재생을위한 개선 된 치료제의보다 합리적인 개발을 지원 ULD.

Introduction

골격 근육 부상 또는 질병 1,2의 질문에 답변 수리 놀라운 고유 능력을 가지고있다. 실험적 응답이 재생의 견고성이 아니라, 예를 들면 학습에 의해 동물 모델에서 설명되었으며 myotoxins (예 cardiotoxin) 3-7의인가 후의 골격근 손상 복구 및 재생 시간 경과. 구체적으로는, 광범위한 cardiotoxin 인한 근육 손상, 재생이 위성 세포에 의해 매개된다 (근섬유 8 38-67%)을 따라 상주 줄기 세포 궁극적 기능 근섬유 4,9-13 성숙 될 것이다. 최종 결과는 포스트의 손상을 건강한 힘 생성 근조직 14-16의 기능 재생을 증가시킨다. 세부 사항이 보고서의 범위를 벗어나는 잘하지만, 근육 재생을위한 기계적인 기초는 canoni을 이용하여 여러 계통에서 다양한 세포 유형의 신중하게 조율 된 이벤트를 반영칼 신호 경로 조직 개발 및 형태 형성 5,17-21 모두에 중요합니다. 중요한 것은, myotoxin에 의한 재생은 세포 외 기질, 신경 세포의 신경 분포와 혈관 관류가 cardiotoxin에 의한 근육 손상 3,8,22 다음과 구조적으로 그대로 유지한다는 사실에 의해 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 이러한 주요 조직 구조 및 구성 요소가 정의상 VML 손상의 문맥에서 완전히 부재하며; 여기서 다양한 원인으로 인해 조직의 솔직한 손실, 영구적 인 기능 및 화장품 적자 23-25 발생합니다.

에 관계없이 다양한 상황에서, myotoxin에 의한 근육 손상에 비해 VML 부상 다음 근육 수리 및 재생, 골격 근육 재생 및 수리를위한 기계적인 기초의 개선 이해와 관련된 추가 과제, 잘 생물학적으로의 활용에 의해 제공 될 것이다 길이 A의 조합으로 중요한 동물 모델관련 기능 측정의 ssessments. 본원에서 논의 된 바와 같이, 래트 뒷다리의 연구는 이러한 목적에 우수한 모델 시스템을 제공한다. 보다 구체적으로, 다리의 배측 굴곡에 대한 책임 전방 crural 구획의 근육 (정강 뼈 앞쪽에, 신근 심지 longus (EDL)와 hallicus의 longus (HL)는), 쉽게 식별 및 조작된다. 또한, 그들은 주요 혈관 (장골 분기)에 의해 제공되고, 다리를 26 ~ 28의 길이를 실행하는 신경 (비골을 포함 좌골 분기)에 의해 신경 지배된다. 이와 같이, 하나의 직접 생체 내에서 골격근 기능 / 병리학을 평가하기 위해 쥐 뒷다리 모델을 사용하거나, 골격근 기능 대응의 혈관이나 신경에 병변과 관련된 변화의 간접적 인 영향을 평가. 두 시나리오에서, 질병의 심각성뿐만 아니라 치료 효과가 근력 생산 (토크) 및 대응하는 다리 m의 함수로서 결정될 수있다29-34 ovement.

이상적으로는, 힘 측정은 조직 학적 연구를 수반 유전자 발현 더욱 엄격히 골격근의 구조와 분자의 상태를 평가하기 위해 분석된다. 기본 조직 학적 및 면역 조직 화학, 예를 들어, 근육의 크기, 근육 섬유 정렬, 세포 외 기질 조성, 핵의 위치, 세포 수, 단백질 현지화에 대한 질문에 답변 할 수 있습니다. 유전자 발현 분석은 다시 / 좌우 근육 섬유, 질환 상태, 대사 활성의 성숙을 조절할 수있는 분자 메커니즘을 식별하는 것이 필요하다. 이러한 방법은 중요한 정보를 제공하지만, 이들은 일반적으로 단말 엔드 포인트를 나타내고, 가장 중요한 것은 바로 골격근의 기능적 용량을 충족하지 못하는, 따라서 라기보다는 상호 원인이다. 그러나, 조직 학적 연구 및 유전자 발현 분석 기능 지표 성과 함께 평가 될 때ES 그러면 동력 생산 및 기능의 재생 메커니즘은 가장 정확하게 식별 될 수있다.

이와 관련하여, 근육의 능력을 생산하는 힘은 동일계에서 또는 생체 내에서, 시험관 내에서 측정 할 수있다. 세 가지 접근 방법은 장점과 한계를 모두 가지고있다. 생체 외 실험에서, 예를 들면, 근육 완전히 절연 및 동물의 몸에서 제거된다. 근육을 공급하는 혈관과 신경의 영향을 제거하여, 상기 조직의 수축 능력이 엄격하게 제어 외부 환경 (35)에서 결정될 수있다. 시츄 근육 테스팅하지만, 시험관 내 제제와 같이, 근육이 분리 될 수 있도록 의 신경 분포와 혈액 공급은 그대로 유지됩니다. 시츄 실험 모델의 이점은 신경 분포 및 혈액 공급이 최소한 36 교란하면서 개인의 근육을 조사 할 수 있다는 점이다. 모두현장 실험 관내 및에서 약물 치료는 주변 조직이나 측정 된 수축 반응 37 순환계의 충격의 영향을 고려하지 않고도보다 직접적으로 적용될 수있다. 그러나, 생체 기능 시험에서, 본원에 기술 된 바와 같이, 네이티브 환경 (38)에서 근육 기능을 평가하기위한 최소 침습 기술이며 (즉, 종 방향) 시간 동안 반복적으로 수행 될 수있다. 이와 같이, 아래의 논의의 초점이 될 것이다.

이와 관련하여, 관심있는 근육하거나 제공하는 운동 신경 근처 삽입 경피 전극 근육에 전기 신호를 제공한다. 트랜스 듀서는 소정의 사용자 정의 소프트웨어 프로토콜의 지시에 따라 활성화 된 근육에서 생성 된 길이 또는 힘의 변화를 측정한다. 이들 데이터로부터, 근육의 물성을 측정 할 수있다. 이들에 대한 포함가전 ​​주파수, 최대 파상풍, 힘 – 속도, 강도, 길이 긴장, 피로. 근육의 길이 또는 힘은 일정하게 유지 될 수 있도록 등방 또는 isotonically 근육 계약. 중요한 것은,이 실험 프로토콜은 빠르게 수행 될 수 쉽게 반복하고 customized- 모든 동물은 마취 상태에서 일 및 시간의 회복기를 가진. 하나의 동물 질병 모델 따라서 또는 치료 플랫폼 / 기술 평가 길이 연구를 가능하게 여러 번 테스트 생체 내 효력을 겪을 수있다.

본원에 기재된 바와 같이, 높은 전력과 함께 상용 근육 레버 시스템은, 바이 – 페이즈 자극기의 자극을 통하여 다리의 배굴에 쥐 뒷다리의 전 경골근의 기여를 평가하는 생체 근육 기능 테스팅을 수행하는 데 사용 비골 신경. 우리는 특히 재생 의학 / TI를 평가하기 위해 설계된 프로토콜을 개발했습니다쥐 TA 근육의 외상 VML 부상 다음 근육 수리 ssue 엔지니어링 기술. 또한 유의해야한다; EDL 및 HL은 구체적으로 (그들이 비골 신경 자극 (코로나 다음 측정 된 총 경골근 토크의 15-20 %를 차지하는 TA 근육을 평가하기 위해 전방 crural 구획에서 절개해야 외., 2013) ). 이 방법은 근육 생리학 / 기능의 포괄적 인 종 분석을 제공하기 때문에, 수많은 다른 생리 학적 조사의 유형뿐만 아니라 질병의 다양한 또는 치료 영역 (39)에 중요한 기계론의 통찰력을 흘렸다 수 있습니다. 예를 들어, 생체 근육 기능 테스트에서 운동 생리학, 허혈 / 재관류 연구, 근육 병증, 신경 손상 / 신경과 혈관, 근육 감소증, 근육 이영양증 (40)의 연구에 적용 할 수있다.

Protocol

모든 동물을 인도적으로 처리하고, 모든 프로토콜은 버지니아 IACUC 대학에 의해 승인되었다. 1. 장비 준비 모든 기계가 제대로 연결되어 있는지 확인합니다. 높은 전력 양방향 상 자극기 및 듀얼 모드 레버 시스템에 의해 다음, 컴퓨터를 켭니다. 이 때, 2 % 이소 플루 란 마취를 공급 챔버에 동물을 배치하고, 플랫폼은 37 ℃로 가열되도록 발열체 켜. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 코팅 팁 침지되고 장치 소프트웨어를 설치하는 동안 살균되도록 70 % 에탄올에 전극을 배치. 찾아 바탕 화면에있는 레버 시스템 제어 소프트웨어를 엽니 다. 참고 :이 기능 테스트를 수행하는 데 필요한 소프트웨어 될 것입니다. 2. 소프트웨어 설치 프로그램 (도 1a)가 개방되면, 파라미터를 변경원하는 값으로 설정 메뉴에서 인스턴트 STIM에 대한의. 참고 :이 프로토콜에서 모든 매개 변수는 180 초 (그림 1B)로 변경됩니다 "실행 시간 (들)"를 제외하고 미리 설정된 수준에서 유지됩니다. 설정 메뉴 아래에 자동 저장 폴더를 만듭니다. "자동 저장 자료"라고 표시된 유형 수 창을 찾습니다. 입력 샘플의 이름, 예를 들면 "Rat1 최신 평가시기". 직접 "자동 저장 자료"유형 수 창 왼쪽에있는 "자동 저장을 사용합니다."로 상자를 클릭 조정 화면의 상단에서 "시퀀서"를 선택합니다. 새 창이 열립니다. 새 창 하단에 "열기 순서"를 선택합니다. 새 창이 열립니다. 미리 만들어진 순서를 선택하고 확인을 클릭합니다. 시퀀스 주파수를 포함하는 매개 변수, 자극의 지속 시간 및 휴식 시간 프로토콜 목록 이름 창에 개발할 것입니다 : 시퀀스 편집기 (그림 1C)를. "로드 순서"를 클릭 -> & #34; 창 닫기 ". > "라이브 데이터 모니터"- 실시간 전류 자극을 확인하려면 "파일"을 선택합니다. 새 창이 열립니다. 새로운 라이브 데이터 창에서, 화면에 표시되는 최대 및 최소 y 값을 입력 수동 오토 스케일 기능을 사용하거나하여 테스트 형식으로 화면. 3. 동물 셋업 주 : 모든 힘의 측정은 11 주 된 루이스 쥐의 것들이다. 근육 질량 (뉴턴)의 힘 생산 간의 선형 상관 관계가있다. 따라서, 쥐 증가 나이, 다리에 의해 생성 된 힘의 값도 증가한다. 동물이 마취 실에서 제거하기 전에 마취의 적절한 비행기에 있는지 확인하십시오. 완전히 발목 및 전기 머리 깎기를 사용하여 실험 다리의 골반 사이의 측면에있는 모든 머리를 제거합니다. 주 : 마취의 적절한면이 달성 될 때 동물 I발가락 핀치에 응답하지이야. 각 기관의 동물 관리 및 사용위원회 내다 지침을 따라야 할 필요가있다. 이 마취의 충분한 깊이로 유지되도록 동물의 코 안전하게 마취 코 콘에 보장 부정사 위치에 동물을 배치합니다. 3 개의 독립적 인 손잡이 (도 2)를 기준으로 페달 장치의 위치를 조절한다. 노브 (A 및 B)를 사용하여, 풋 페달을 조정 각각의 맨 왼쪽과 낮은 위치의 페달 장치를 배치한다. 이후의 조작을위한 공간을 남겨 두면서이 동물의 다리의 정확한 위치 결정을 가능하게 할 것이다. 이 위치에서, 동물 다리 직선 평면에 놓 이도록 방향 또는 멀리 실험에서 두 장치를 이동하는 트랙의 왼쪽에 손잡이를 사용한다. 요오드와 알코올의 세 가지 변화에 다리를 청소합니다. 요오드는 30 초 동안 다리에 남아 있어야한다. 동물 또는 플랫폼을 조정(그림 2A, D) 확장 된 다리는 발바닥과 발 페달 사이의 완전한 접촉을 보장하도록. 의료용 테이프를 이용하여, 발판 (도 2D)에 대한 동물의 발을 고정. 발 뒤꿈치가 페달과 발 전체의 바닥에 대한 높이가 평평하고 테스트하는 동안 판에서 꺼 내려하지 않을 것이 중요합니다. 다리를 안정 클램핑 메커니즘을 찾습니다. 알렌 렌치를 돌려 다리의 움직임을 줄이고 제자리에 고정하기 위해 충분히에서 안정화 핀을 밀어 넣습니다. 이 위치에서, 안쪽 또는 바깥쪽으로 실험자에서 어느 장치를 이동하려면 노브 C를 사용되도록 직선 (그림 2C)에서 발목, 경골 및 대퇴골 거짓말. 다리는 발 페달과 평행이 있는지 확인합니다. 발과 경골이 90 ° 위치에 있습니다 천천히 발목을 이동, 과정 및 장치의 뒷면에 미세 노브에 조정을합니다. 연속 주전자는 대퇴골 있도록 다리를 이동하고 경골은 90도 수직 각도 (그림 2B)에 있습니다. 이 시점에서, 동물 전극에 대한 준비가되어 있습니다. 전극의 배치 4. "인스턴트 STIM"로 표시된 오렌지색 버튼을 클릭하여 "인스턴트 STIM"을 활성화합니다. 경골근의 기단부에 피상적으로 두 전극을 놓고 스파이크 라이브 모니터에서 볼 때까지 주위에 전극의 끝 부분으로 이동합니다. 이상적으로, 스파이크 0.4 N. 주위해야한다 참고 : 전극 차례로, 경골의 무릎에서 수직 측면 실행 비골 신경의 평면에 인접 및 직교 배치해야합니다. 피어싱 진피에 충분히, 그리고 거의 근육 층에 하나의 바늘을 삽입합니다. 스파이크는 0.6 N. 삽입 바늘 주위의 라이브 모니터에서 볼 때까지 주변의 다른 전극을 이동 취미 클램프 또는 의료 테이프를 사용 장소로 클램프. 에이djust 일반 및 미세 조정은 최대 힘 출력을 찾을 수 있습니다. 고전력 바이 – 페이즈 자극기에서 중앙에 두 개의 손잡이가있을 것이다. 하나는 "RANGE"로 표시된 다른 하나는 "조정"입니다. 원하는 최대 전류량에 "RANGE"노브를 돌립니다. 주 : 피크 강도가 서서히 증가하며, 최대 전류량 연속 3 자극이 동일 수축 반응을 초래하는 레벨로 결정된다. 필요 이상으로 암페어 높은 회전 저항; 최대 암페어 계약을 체결 할 수있는 전체 근육을 자극하지만, 어떤 높은 전류는 주변 근육의 채용을 초래할 것이며, 잠재적으로뿐만 아니라 길항제. 근육을 자극하는 데 사용되는 "RANGE"의 비율을 설정합니다 "조정"노브를 돌립니다. 이 지점에서, 힘은 약 1.0 N. 읽어야이 전류의 증가 또는 감소를 요구할 수있다. 그들이 안전한지 확인하기 위해 전극을 다시 확인. 중지인스턴트 STIM. "라이브 데이터"창에서 "시퀀스를 시작합니다."를 클릭 다시 조정 화면에 가고, 그리고 오렌지 "인스턴트 STIM"버튼 위에있는 "분석"버튼을 클릭하여 곡선을 모니터링하기 위해 계속합니다. 파상풍 곡선은 60 Hz의 자극 주위에 모양을하기 시작한다. 5. 자극과 정리 마무리 시퀀스가 종료 된 후, 전극을 제거하고 70 % 알코올로 닦아. 커버에 전극을 배치합니다. 무릎 클램프를 풀고 마취의 전원을 끄십시오. 마취 가스에서 동물을 제거하고 가열 패드에 여전히 발생하기 쉬운 위치에 동물을 배치합니다. 이소 플루 란 가스가 산소 쥐를 유지하기 위해 해제 된 후 몇 분 동안 100 % O 2의 쥐를 유지한다. 동물은 초기에 이동시킬 수 있지만, 동물은 의식을 회복 할 때까지 케이지로 다시 동물을 돌려주지 않는다. 근육통이 발견 된 경우당신의 동물 관리위원회에 의해 지정된 복구에, NSAID의 용량을 제공한다. 단계 1.2에 나와있는 모든 장비의 전원을 끄고, 소프트웨어를 닫고, 데이터 분석을 계속합니다. 플랫폼과 발 페달을 닦습니다. 6. 데이터 분석 주 : 데이터 분석이 실험에 의해 설계 및 실험 프로토콜에 따른 시퀀스에 맞게 수행된다. 분석 값 중요한 데이터 요소 및 방법의 다른 측면은 사용자의 의도에 따라 변경된다. 데이터 분석 소프트웨어를 엽니 다. 한 번에 여러 데이터 파일 (샘플)의 분석을 가능하도록 높은 처리량의 메뉴를 클릭합니다. "힘 주파수"분석을 선택합니다. "파일 선택"버튼을 클릭하고 원하는만큼의 저장 데이터 파일을 엽니 다. 커서 배치 방법 상자에 "수동"을 선택합니다. 주의 : 이는 사용자가 DAT 전부를 분석 할 수 있도록A A 원하는 타임 스탬프 내에 프로그램 반대로 자동 분석 위치를 선택한다. 2. 최종 커서 타임 스탬프 값을 변경하면 "분석"버튼 (그림 1D)를 클릭합니다. 테이블을 저장하고 스프레드 시트를 사용하여 데이터를 분석하고, 버튼을 ACSII 위해 "테이블 저장 클릭.이 파일을 저장하며, 그것은 나중에 스프레드 시트를 열 수있다. 스프레드 시트에 저장된 데이터 파일을 엽니 다. "절대 최대"이라는 추가 열을 생성하고베이스 라인과 각 샘플에 대한 최대 값 사이의 차이를 결정한다. 이는 각각의 주파수에서 발생되는 총 최대 힘을 ​​제공 할 것입니다. 토크를 결정하기 위해 레버 아암의 길이가 각각의 힘 값을 곱한다. 주 :이 경우는 해당 동물의 다리 길이에 의해 표현 될 것이다. 이 프로토콜은 30mm의 평균 실험적으로 결정된 값을 사용합니다. 사용자는 현재 MA에 대한 값을 결정한각각의 주파수에서 생산 ximum 토크. 토크 곡선의 주파수 또는 모든 주파수에 걸쳐 자극은 동물에 의해 생성 된 최대 토크로이 값을 그래프. 주 : 이것은 식별 된 샘플을 비교 한 지점으로 사용될 수있다.

Representative Results

파상풍 곡선 차선의 결과에서 최적의 결과를 구별하기 위해 사용될 수있다. 이 곡선은 일반적으로 60 Hz의 주파수에서 형성하기 시작한다. 양호한 결과를 얻기위한 중요한 요소는 그것의 최대 힘을 ​​생성 파상풍 동안 그 힘을 유지하도록 근육을 자극하는 능력이다. 이상적인 곡선은 최소의 진동과 평평한 고원 단계 다음에 자극시의 중단, 날카로운, 수직 상승, 자극의 종료에서 중단, 날카로운 수직 감소 기간 (그림 4)이 있어야합니다. 이상적인 곡선의 편차는 근육 피로 표시된다 (도 5d) 또는 근육이 적절하게 최대 힘을 생성하도록 자극하고 있지 않은지 (도 5b – C). 후자는 일반적으로 stimula 동안 근육 섬유의 최대 모집의 실패로 이어지는 잘못된 전극 배치의 결과기. 근육에는 파상풍 곡선 (융합) 완전하거나 (융착) 불완전 여부되는 비 – 이상적인 곡선 잘못된 전극 배치 또는 병리학 적 변화의 결과 인 경우에 연구를 가능하게하는 큰 특징을 결정한다. 융합, 불완전 파상풍 곡선은 근육이 최대한의 수축을 경험하지의 결과로, 전극이 잘못되었음을 나타냅니다. 제어하거나 그보다 빠르게 피로 수축성 반응에 비해 최대 수축 감소로 근육의 병적 변화의 예를 볼 수있다. 이 절차의 과정을 통해 수득 된 피크의 세 가지 유형이 다른 전극과 다리의 위치를 나타내고,도 3에서 볼 수있다. 첫 번째 피크가 0.4N 주위 올바른 전극 배치는 피부 (도에 피상적 결정될 때 발생할 3A). 피크의 제 2 세트는 H를 가지고igher 진폭, 일반적으로 약 0.5-0.6N (그림 3B)와 전극이 진피 관통 할 때 발생합니다. 이 수득 된 후, 다리와 발을 달성 동력 생산을 최대화하도록 조정될 때 약 1N 이상 (도 3c)의 피크 진폭이 증가한다. 이때 STIM 즉시 해제 할 수 있으며, 시퀀스가 ​​시작된다. 이 지침은 정확하고 재현성있는 결과를 확인하고 프로토콜 전반에 걸쳐 중요한 체크 포인트이다. 최종 결과는 사용자가 힘을 테스트 및 실험 설계에서 추출 된 정보에 따라 다른 방식으로 표현 될 수있다. 이 프로토콜에서, 최대 힘은 자극의 모든 주파수에 걸쳐 측정하고, 그러나 다른 데이터 포인트는 특정 연구 또는 응용에 중요 할 수있다. 일례 파상풍 곡선 형상을 취하도록 시작되는 자극의 주파수이다. 티그 데이터는 동일 동물에서, 또는 다른 처리 군 사이의 비교를 위해 이전 또는 이후의 실험에서 얻은 다른 결과를 비교할 수있다. 포스 생산 아이소 힘을 계산하고, 관찰 된 최대 수축 연령의 영향을보다 공평 평가를 제공 체질량에 의해 정규화 될 수있다. 다른 체중 및 연령의 동물들은 다양한 최대 힘을 ​​생성되지만 과정이 정확하게 수행 될 때, 파상풍 곡선의 형태는 모든 그룹 간의 일치한다. 도 1 : 레버 시스템 제어 및 분석 데이터 분석 소프트웨어 개요 제어 소프트웨어 (A) 개요 프로그램을 열고.. (B)를위한 매개 변수 "인스턴트 STIM." 힘 주파수 자극 (C) 예 순서. (D </st룽>) 분석 소프트웨어의 높은 처리량 힘 주파수 분석 대표 데이터. 예를 순서 및 데이터 분석 절차는이 프로토콜에 고유 한이 소프트웨어에서 제공하는 시퀀스 출력의 전체 범위를 나타내지 않는 것을 유의해야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 :. 장치에서 발의 쥐의 위치 및 배치 (A)에 대한 중요한 측면 쥐 안전하게 발판에 부착 된 왼쪽 다리와 부정사 위치에있다. 발, 다리, 허벅지 만든 직각을 원하고 있습니다. (B) 발목에 의해 생성 된 직각이 강조 표시됩니다. (C) 다리해야 발에서 몸에 직선 평면에 정렬 될 수있다. (D) 전극 배치가 병렬 및 비골 신경의 평면에 직교한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : 대표 봉우리는 최대한 힘 생산에 올바른 전극 위치의 중요성을 입증 너무 피상적으로 배치 된 전극에서 관찰 (A) 기준 피크 파상풍의 응답.. (B) 올바른 위치에 삽입 된 전극 큰 봉우리. 다리와 발 위치로 최적의 사전 시퀀스 피크 진폭에 대한 정확한 전극 배치 신호 큰 봉우리에서 (C) 전환이 최적으로 조정됩니다./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4 :. 100 Hz에서 최적의 파상풍의 곡선이 곡선이 증가하고 급격히 감소하고 평평한 고원 단계가 있습니다. 이 예는 올바른 전극 배치 및 최대 힘의 자극을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5 :. 100 Hz에서 획득 하위 최적의 파상풍 곡선의 대표 예 (A) 휴식 후,이 곡선은 기준 이하로 떨어진다. 이는 자극 나타낸다길항제. (B – D)이 그래프는 부적절한 전극 배치 및 근섬유의 불균등 채용의 결과이다. 고원 단계 큰 진동 (B), 상향 경사 (C) 또는 하향 기울기 (D)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 쥐 뒷다리의 앞쪽 crural 구획에 생체 근육 기능 테스트에서 수행하는 비교적 간단한 방법을 보여줍니다. 생체 포함하고 시츄 프로토콜에서 근육 생리학에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있는 근육 기능 테스팅의 다른 형태. 그러나, 생체 기능 테스트의 의미는 비 침습적 인 성질에 달려 있으며이 가장 정확하게 근육 자극 내인성 메커니즘 되풀이되었습니다 사실. 모두 생체과 현장 테스트, 힘줄 및 / 또는 근육에 노출되고, 따라서는, 습기가 유지 또는 41, 42 잠수해야합니다. 생체 내 테스트는 요구되는 수술로 인해 발생할 수 있습니다 외상과 염증의 혼란 변수를 제거 대한 현장 근육 기능 테스트에; 이 실험의 목적은 염증 및 세포 과정을 조사하는 경우에 특히 중요 <s> 43입니다. 또한, 생체 내 실험 근육이 그 주변에서 고립되지 않고 근육 / 건 미끄러짐을 줄이기 위해 정확한 매듭을 필요로하지 않는 작은 수술 기술이 필요 (41) (의 경우와 같이 현장 또는 생체 외 시험에서). 또한, 충분한 연습 정확한 전극 위치의 속도를 빠르게하는 프로토콜 완성 빠르다 보장 동물 내에서 동일한 장비 (39)의 여러 사용자를 통해 모두 reproducible- 할 근육의 최대 동력 생산을 얻기 위해 조정하는 기능 . 전에 TA 근육의 직접적인 조사를 위해 적은 접근 시너지 근육 (EDL과 HL)의 절단에, 그림과 같이 전체 전방 crural 구성 요소의 평가로 시작하는 도움이됩니다. 이 방법을 사용하여, 하나보다는 빠르게 기술의 숙달을 달성 할 수있다. 본 명세서에 설명 된 절차를 보여주고 힘 FR의 유용성을 강조하지만equency 프로토콜은 근육에 의해 생성되는 최대 힘을 ​​파상풍을 유도하고 결정하기 위해 사용자가 가장 특정 실험 (들) 및 연구 목적을 통보 할 기능 시험의 유형 (들)을 결정한다.

신중 자극 파라미터의 다양한 근육에 의해 최적의 재현성 실험 결과를 보장하기 위해, 즉, 일관성있는 최대 동력 생산을 수행해야 몇 가지 중요한 단계가있다. 주요 기능 중 일부는 그림 2에 설명되어 있습니다. 그러나, 적절한 배치와 자극 전극의 안정성은 비골 신경의 재생 가능한 최대한의 자극에 대한 절대적인 전제 조건이다. 이와 관련하여, 전극 표면으로 배치되어야한다. 즉, 상기 전극 위치가 너무 깊은 경우, 하나 따라서 전방 crural 구획 관찰 수축 반응의 크기를 감소, 길항근의 직접적인 전기 자극을 위험하다. 또한,두 전극 주변의 피부 및 결합 조직의 전기 저항을 줄이기 위해 가능한으로 서로 가깝게 근접하여 배치되어야한다. 일반적으로, 직접적으로는 비복근을 충족하는 경우에 전 경골근의 가장자리를 추적 다리의 무릎 가까이 내측 전극의 위치는 종종 적절한 힘 생산을 산출한다. 또한이 전극들이 차례로, 경골에 수직 및 측 방향으로 무릎에서 다리 내려가는 비골 신경의 평면에 직교하는 인접 배치되는 것을 보장한다. 그러나 동물 사이의 해부학의 자연적인 변화는 전극 배치가 경우에 따라 최적화하기 위해 일정한 경계가 필요합니다. 이와 같이, 상당히 사용자의 경험에 의해 감소되고, 전극 배치와 관련된 시행 착오 어느 정도있다. 나 감소 전극 피부 염증 및 부종을 감소시키기 위해 최소화되어야한다 관통 횟수asured 힘 생산. 이 바늘은 처음에 배치되는 위치에 의존 있지만 슬개골의 주변에 덜 특히 바늘 두 번 이동하거나 추천합니다. 전극은, 동물의 다리에 배치되면 마지막으로, 약간의 조정은 다리의 위치 및 전극을 통해 전달되는 전류에 이루어질 수있다. 동시에 하나의 트에서 생산 된 힘을 모니터링하면서이 수행해야합니다. 전극 배치에 더하여, 조정은 전극을 가로 질러 전달되는 전압으로 할 수있다. 그러나, 여기에 설명 된 설정에서, 동력 출력을 증가시키기위한 방법으로, 전압이 증가 할 때 증가 된 전압은 그 정신 자극 길항근 신경을 자극하기 때문에주의를 사용하는 것이 중요하다.

전극 배치가 최적 유지하기 위해 모니터링해야합니다 세 가지 핵심 기술 문제가 있습니다. 첫째, 마취 동물의 발은 확실하게해야합니다근육 력 생산 (도 2)을 측정하는 풋 페달 장치에 고정. 다리가 완전히 고정되어 있지 않은 경우, 근육에 의해 생성 된 실제 힘이 불완전 힘 센서로 번역 될 수있다. 불안정한 발 고정도 정상 근육 수축 이후 운동으로 전극의 최적의 배치를 잃을 위험을 도입 (즉, 거리 발판에서 이동하는 다리)는 그 표면 위치에서 전극의 변위가 발생하거나 완전히 빠지지. 어느 시나리오는 측정 된 힘을 감소합니다. 둘째, 동물의 몸은 완전히 부정사와 직선 평면 (그림 2)으로 정렬해야한다. 동물의 몸의 올바른 위치로 인해 호흡에 다리의 약간의 움직임을 방지하고, 또한 더 나은 위치와 자극 전극의 지속적인 접촉을 가능하게 다리와 골반의 비틀림을 최소화한다. 무릎 셋째, 정확한 위치 및 고정은 criti입니다칼은 다리가 꾸준히 유지되도록, 따라서 비골 신경의 일관된 활성화를 허용하도록 자극 전극의 최적의 위치를 ​​안정화하는 데 도움이됩니다.

강조되어야 할 몇 가지 추가 사항이 있습니다. 먼저, 상업적 근육 레버 시스템은 왼쪽 다리에 테스트를 수행하도록 설계되어 있지만 설치도 오른쪽 다리에 테스트를 수행하도록 변형 될 수있다. 사용자가 사용하는 플랫폼을 측정하고 선택의 동물 모델에 의해 생성되는 힘을지지하기에 적합한 것으로 확인해야하므로 둘째, 근육 레버 시스템은, 동물의 크기에 기초하여 선택 될 수있다. 장비 플랫폼에 대한 검증 근육은 다리의 발바닥 확장 또는 배측 굴곡을 유도 것들로 제한됩니다. 셋째, 다시 전극 배치가 어려울 수과 인내가 필요하며 기술을 습득하는 연습을 할 수 있음을 강조한다. 전극은 또한 정기적으로 사용하여 신속하게 무딘 될, 그래서 몇 가지 여분의를하는 것이 도움이된다그것은 표면적으로 피부를 찌르 어려워진다 번에 대한 ETS. 셋째,이 보고서에 기술 된 프로토콜은 특정한 자극 서열 데이터 분석 절차를 이용한다. 근육 레버 시스템 제어 소프트웨어 및 데이터 분석 소프트웨어와는 다른 많은 실험 질문 때문에 응답 할 수 제공하는 데이터는 그 유틸리티는 본원에 설명 된 것 이상 연장된다. 따라서, 사용자는이 논문에서 제시 한 소프트웨어 프로토콜 (들)의 한계를 넘어 탐험하는 것이 좋습니다. 이러한 사소한 제한에도 불구하고, 생체 근육 기능 테스팅은 침습적이고 동일한 동물에 오랜 기간에 걸쳐 여러 차례 수행 될 수 있기 때문에, 골격근의 건강과 수축 기능을 결정하기위한 강력한 방법이다. 즉, 수리 할 수있는 유용성이 유형 래트 뒷다리 골격근 손상 또는 질병에 대한 새로운 치료의 효과를 테스트 시스템에 특히 능숙한다.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.

Materials

Isothesia Henry Schein Animal Health 05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill Vet Equip 911103
Inlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911124
Outlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911125
Tabletop Anaesthesia Machine Vet Equip 901801
Compressed oxygen gas Praxair N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter Vet Equip 931401
T/Pump Professional water heater Stryker N/A set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape 3M 1527S-1 rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers Oster 078005-050-002
Povidone-Iodine Solution Aplicare 82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol Decon labs diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators Puritan 836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode Chalgren Enterprises 111-725-24TP
servomotor Cambridge Technology Model 6650LR
Dual Mode Lever System Aurora Scientific Inc Model 305C-LR-FP contact manufacturer to order
Signal Interface Aurora Scientific Inc Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc Model 701C
Data analysis software Aurora Scientific Inc DMAv5.110 software
Muscle lever system control software Aurora Scientific Inc DMCv5.400 software
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参考文献

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Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. J. Vis. Exp. (116), e54487, doi:10.3791/54487 (2016).
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