applicazioni di<em> In Vivo</em> Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione
概要
We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.
Abstract
Nonostante la capacità di rigenerazione del muscolo scheletrico, deficit funzionali e / o estetici permanenti (ad esempio, la perdita muscolare volumetrico (VML) derivanti da lesioni traumatiche, le malattie e le varie condizioni congenite, genetiche e acquisite sono abbastanza comuni. L'ingegneria dei tessuti e delle tecnologie di medicina rigenerativa hanno un enorme possibilità di fornire una soluzione terapeutica. Tuttavia, l'utilizzo di modelli animali biologicamente rilevanti in combinazione con valutazioni longitudinali di misure funzionali pertinenti sono fondamentali per lo sviluppo di migliori terapie rigenerative per il trattamento di lesioni VML-simili. a questo proposito, un leverismo muscolare commerciale può essere utilizzato per misurare la lunghezza, tensione, forza e parametri di velocità nei muscoli scheletrici. Abbiamo usato questo sistema, in combinazione con una potenza elevata, stimolatore bi-fase, per misurare in vivo produzione della forza in risposta all'attivazione del compartimento crural anteriore il arti posteriori del ratto. Abbiamo previusato neamente questa apparecchiatura per valutare l'impatto funzionale di lesioni VML sul muscolo tibiale anteriore (TA), nonché l'entità del recupero funzionale dopo il trattamento del muscolo TA ferita con la tecnologia dell'ingegneria tessutale riparazione muscolare (TEMR). Per questi studi, il piede sinistro di un ratto anestetizzato è ancorata saldamente ad una pedana collegata ad un servomotore, e il nervo peroneo comune è stimolata da due elettrodi ad ago percutanee per suscitare la contrazione muscolare e dorsiflessione del piede. Il nervo peroneo stimolazione indotta contrazione muscolare è misurato su una gamma di frequenze di stimolazione (1-200 Hz), per garantire un eventuale plateau in produzione della forza che consente una determinazione accurata del picco forza tetanica. Oltre alla valutazione dell'entità del pregiudizio VML nonché il grado di recupero funzionale dopo il trattamento, questa metodologia può essere facilmente applicato per studiare diversi aspetti della fisiologia muscolare e fisiopatologia. Un tale approccio shoULD assistere con lo sviluppo più razionale delle terapie migliorati per la riparazione del muscolo e la rigenerazione.
Introduction
Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità intrinseca per la riparazione in risposta a infortunio o malattia 1,2. Sperimentalmente, la robustezza di questa risposta rigenerativa è stata ben documentata in modelli animali studiando, ad esempio, la durata del danno muscolare scheletrico, riparazione e rigenerazione dopo l'applicazione di myotoxins (ad esempio, cardiotossina) 3-7. In particolare, a seguito di ingenti danni muscolari cardiotossina-indotta (38-67% delle fibre muscolari 8), la rigenerazione è mediata da cellule satelliti, le cellule staminali residenti che maturare per diventare in ultima analisi, le fibre muscolari funzionali 4,9-13. Il risultato finale è aumentata dopo il danno la rigenerazione funzionale di salute, forza produttrici di tessuto muscolare 14-16. Anche se i dettagli sono ben oltre la portata di questo rapporto, la base meccanicistica per la rigenerazione muscolare riflette gli eventi attentamente orchestrata di numerosi tipi di cellule provenienti da più linee utilizzando canonical vie di segnalazione critica sia per lo sviluppo del tessuto e la morfogenesi 5,17-21. È importante sottolineare che la rigenerazione myotoxin-indotta è abilitato dal fatto che la matrice extracellulare, innervazione neuronale e la perfusione del vaso sanguigno rimangono strutturalmente intatti seguente cardiotossina indotta danno muscolare 3,8,22. In netto contrasto, queste strutture tissutali chiave e componenti sono, per definizione, tutto assente nel contesto di lesioni VML; dove la perdita di tessuto franca, a causa di una varietà di cause, si traduce in deficit funzionali ed estetici permanenti 23-25.
Indipendentemente dalle sfide aggiuntive associate alla riparazione del muscolo e la rigenerazione dopo un trauma VML rispetto al danno muscolare myotoxin-indotta, una migliore comprensione della base meccanicistica per la rigenerazione del muscolo scheletrico e la riparazione, in una varietà di contesti, sarebbe ben servito da utilizzo di biologicamente modelli animali in combinazione con un longitudinalessessments di misure funzionali pertinenti. Come discusso qui, gli studi di arti posteriori del ratto forniscono un sistema modello eccellente per questo scopo. Più in particolare, i muscoli del compartimento crurale anteriore (tibiale anteriore, estensore lungo delle dita (EDL) e hallicus longus (HL)), che sono responsabili per la flessione dorsale del piede, sono facilmente identificabili e manipolati. Inoltre, essi sono serviti da grandi vasi sanguigni (iliaci e rami), e sono innervati dai nervi (sciatico e rami, compreso peroneo) che corre lungo della gamba 26-28. In quanto tale, si può usare il modello di ratto arti posteriori per valutare direttamente il muscolo scheletrico funzione / patologia in vivo, o per valutare l'impatto più indiretto di alterazioni patologia correlata nei vasi sanguigni o nervi sulla corrispondente funzione del muscolo scheletrico. In entrambi i casi, la gravità della malattia, e l'efficacia del trattamento può essere determinato in funzione della produzione di forza muscolare (coppia) e corrispondente piedino movement 29-34.
Idealmente, misure di forza sono accompagnati da studi istologici e l'espressione genica analisi per valutare in modo più rigoroso lo stato strutturale e molecolare del muscolo scheletrico. istologia base e immunoistochimica, per esempio, sono in grado di rispondere a domande relative alla dimensione del muscolo, l'allineamento delle fibre muscolari, la composizione della matrice extracellulare, la posizione dei nuclei, numero di cellulare, e la localizzazione della proteina. Analisi dell'espressione genica, a sua volta, è necessaria per identificare i meccanismi molecolari che possono influenzare / modulare la maturità delle fibre muscolari, stati di malattia, e l'attività metabolica. Mentre questi metodi forniscono informazioni cruciali, in genere rappresentano gli endpoint terminali, e, soprattutto, non riescono ad affrontare direttamente la capacità funzionale del muscolo scheletrico, e, quindi, sono correlativi piuttosto che causale. Tuttavia, quando gli studi istologici e le analisi di espressione genica sono valutati in collaborazione con measur funzionalees, quindi, meccanismi di produzione di forza e la rigenerazione funzionale possono essere identificate più accuratamente.
A questo proposito, la forza producendo capacità di un muscolo può essere misurata in vitro, in situ o in vivo. Tutti e tre gli approcci hanno entrambe vantaggi e limiti. In un esperimento in vitro, per esempio, il muscolo è completamente isolato e rimosso dal corpo dell'animale. Rimuovendo le influenze dei vasi sanguigni e nervi che forniscono il muscolo, la capacità contrattile del tessuto può essere determinata in un ambiente esterno strettamente controllato 35. Nel test muscolare in situ permette al muscolo di essere isolato, come con le preparazioni in vitro, tuttavia , l'innervazione e afflusso di sangue rimangono intatti. Il vantaggio del modello sperimentale in situ è che permette un singolo muscolo da esaminare mentre l'innervazione e apporto di sangue è minimamente perturbato 36. In entrambein vitro ed in situ, trattamenti farmacologici possono essere applicate più direttamente senza dover tener conto degli effetti di eventuali tessuti circostanti o l'impatto del sistema circolatorio sulle risposte contrattili misurati 37. Tuttavia, nei test funzione vivo, come qui descritto, è la tecnica meno invasiva per valutare la funzione muscolare nel suo ambiente nativo 38, e può essere eseguita ripetutamente nel tempo (cioè, longitudinalmente). Come tale, esso sarà il punto focale della discussione seguente.
A questo proposito, elettrodi percutanei inseriti nei pressi del muscolo di interesse, o il nervo motore che serve, forniscono un segnale elettrico al muscolo. Un trasduttore misura quindi la lunghezza o la forza risultante cambiamenti nel muscolo attivato come indicato da un predeterminato, protocollo di software personalizzato. Da questi dati, le proprietà fisiche del muscolo può essere determinato. Questi includono perce-frequenza, il tetano massimale, forza-velocità, la rigidità, la tensione di lunghezza, e la fatica. lunghezza del muscolo o la forza possono essere tenute anche costante in modo che il muscolo si contrae isometrico o isotonicamente. È importante sottolineare che questi protocolli sperimentali possono essere rapidamente eseguite, facilmente ripetuto, e customized- tutto mentre l'animale è anestetizzati e con un periodo di recupero di ore o giorni. Un singolo animale può subire で vigore vivo test più volte, consentendo in tal modo studi longitudinali di modelli di malattia o di valutazione delle piattaforme terapeutici / tecnologie.
Come qui descritto, un sistema di leve muscolare commerciale in congiunzione con una potenza elevata, bifase stimolatore viene utilizzato per eseguire test in vivo funzione muscolare per valutare il contributo del muscolo tibiale anteriore della hindlimb ratto dorsiflessione del piede tramite stimolazione il nervo peroneale. Abbiamo sviluppato un protocollo che è specificamente progettato per valutare la medicina rigenerativa / TItecnologie di ingegneria SSUE per la riparazione del muscolo seguenti ferita traumatica VML del ratto TA muscolare. Dovrebbe essere notato; la EDL e HL devono essere sezionato dal vano crural anterior per valutare specificamente muscolo TA (che rappresentano circa il 15-20% della coppia totale tibiale anteriore misurata dopo stimolazione del nervo peroneale (Corona et al., 2013) ). Perché questo approccio fornisce un'analisi longitudinale completa del muscolo fisiologia / funzione, può gettare importante intuizione meccanicistica su numerosi altri tipi di indagini fisiologiche, nonché una varietà di malattie o di aree terapeutiche 39. Ad esempio, in vivo test di funzionalità muscolare è applicabile a studi di fisiologia dell'esercizio, ischemia / riperfusione ricerca, miopatia, danni ai nervi / neuropatia e vasculopatia, sarcopenia, e distrofie muscolari 40.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo illustra un metodo relativamente semplice per eseguire test で funzione muscolare vivo sul vano crurale anteriore del hindlimb ratto. Altre forme di test di funzionalità muscolare, tra cui ex vivo e nei protocolli in situ, può anche fornire informazioni importanti sulla fisiologia muscolare. Tuttavia, il significato di test in vivo funzione risiede nella sua natura non invasiva, e il fatto che ricapitola più esattamente meccanismi endogeni di stimolazione muscolare. Per entrambi ex vivo e prove in situ, il tendine e / o muscolari sono esposti, e, quindi, deve essere tenuto umido o sommerse 41,42. Sperimentazione in vivo rimuove variabili confondenti di traumi e l'infiammazione che possono essere causati dalle procedure chirurgiche necessarie per le prove in situ funzione muscolare; questo è particolarmente importante se l'obiettivo dell'esperimento è quello di indagare i processi infiammatori e cellulari <sup> 43. Inoltre, la sperimentazione in vivo richiede poca abilità chirurgica come il muscolo non è isolata dal suo ambiente e non richiede nodi precise per ridurre il muscolo / tendine slittamento (come è il caso per in situ o ex vivo) 41. Inoltre, con la pratica sufficiente, la velocità di posizionamento degli elettrodi corretta e la possibilità di effettuare rapidamente le regolazioni per ottenere una produzione forza massima del muscolo farà in modo che il completamento protocollo è rapido e reproducible- sia all'interno animali e tra diversi utenti della stessa apparecchiatura 39 . E 'utile per cominciare con una valutazione di tutta la componente crurale anteriore come illustrato, prima di escissione dei muscoli sinergici meno accessibili (EDL e HL) per ulteriori indagini dirette del muscolo TA. Usando questo approccio, si può ottenere piuttosto rapidamente padronanza della tecnica. Mentre la procedura descritta dimostra ed evidenzia l'utilità di un fr forzaprotocollo equency per indurre il tetano e determinare la forza massima prodotta da un muscolo, gli utenti dovrebbero determinare il tipo (s) di test funzionali che sarebbe meglio informare i loro esperimento specifico (s) e obiettivi di ricerca.
Ci sono diversi passaggi critici che devono essere attentamente eseguite per garantire risultati sperimentali ottimali e riproducibili, cioè, la produzione massima forza costante dal muscolo ad una varietà di parametri di stimolazione. Alcune delle caratteristiche chiave sono descritte nella Figura 2. Tuttavia, il corretto posizionamento e la stabilità dell'elettrodo stimolante è un prerequisito assoluto per riproducibili stimolazione massima del nervo peroneale. A questo proposito, gli elettrodi devono essere posizionati superficialmente. Cioè, se il posizionamento dell'elettrodo è troppo profonda, si rischia di stimolazione elettrica diretta dei muscoli antagonisti, diminuendo così l'ampiezza della risposta contrattile osservato del vano crural anteriore. Inoltre, ladue elettrodi devono essere posizionati come in prossimità l'uno all'altro come possibile ridurre la resistenza elettrica della pelle e del tessuto connettivo circostante. In generale, il posizionamento degli elettrodi vicino al ginocchio e mediale alla gamba tracciare direttamente il bordo del tibiale anteriore, fino ad incontrare il gastrocnemio spesso produce produzione di forza adeguata. Questo assicura anche che gli elettrodi sono posti adiacenti e ortogonale al piano del nervo peroneo, che a sua volta, è perpendicolare alla tibia e lateralmente lungo la gamba dal ginocchio. Tuttavia, la variabilità naturale in anatomia tra gli animali richiede una costante vigilanza per assicurare che il posizionamento degli elettrodi è ottimizzato in caso per caso. Come tale, c'è un certo livello di prova ed errore associato al posizionamento degli elettrodi che è significativamente ridotta dalla esperienza dell'utente. Il numero di volte che gli elettrodi perforare la pelle deve essere ridotto al minimo per ridurre il gonfiore e l'infiammazione, che mi diminuisceproduzione di forza asured. Questo dipende in cui gli aghi sono inizialmente posizionati, ma si raccomanda di spostare gli aghi due volte o meno in particolare nella zona intorno alla rotula. Infine, una volta che gli elettrodi sono posizionati nella gamba dell'animale, piccole regolazioni possono essere apportate al posizionamento della gamba e la corrente erogata attraverso gli elettrodi. Questo dovrebbe essere fatto contemporaneamente il monitoraggio della forza prodotta da una singola contrazione. Oltre al posizionamento degli elettrodi, le regolazioni possono essere effettuate anche alla tensione erogata attraverso gli elettrodi. Tuttavia, nella configurazione descritta qui, è importante prestare attenzione quando si aumenta la tensione, come un modo per aumentare la produzione forza, perché l'aumento della tensione sarà stimolare i nervi che innervano muscoli antagonisti.
Ci sono tre problemi tecnici chiave che devono essere monitorati per assicurare che il posizionamento degli elettrodi rimanga ottimale. Innanzitutto, il piede dell'animale anestetizzato deve essere saldamenteancorato all'apparecchio pedale, che misura la produzione della forza muscolare (Figura 2). Se il piede non è ancorata, la vera forza prodotta dal muscolo può essere incompleto tradotto al trasduttore di forza. Fissaggio piede instabile introduce anche il rischio di perdere il posizionamento ottimale degli elettrodi come movimento oltre la normale contrazione muscolare (cioè il piede allontanandosi dalla pedana) può causare lo spostamento degli elettrodi dalla loro posizione superficiale o rimuovere completamente. Entrambi i casi si riduce la forza misurata. In secondo luogo, il corpo dell'animale dovrebbe essere completamente supina e allineate in un piano rettilineo (Figura 2). Il corretto posizionamento del corpo animali impedisce leggeri movimenti della gamba dovuto alla respirazione, e minimizza anche torsione della gamba e del bacino, consentendo un migliore posizionamento e continuo contatto degli elettrodi stimolanti. Terzo, il corretto posizionamento e l'ancoraggio del ginocchio è critical per garantire che la gamba rimane costante, e pertanto, aiuta a stabilizzare il posizionamento ottimale degli elettrodi stimolanti per consentire l'attivazione coerente del nervo peroneale.
Ci sono alcuni punti aggiuntivi che deve essere valorizzato. Innanzitutto, il sistema di leve muscolare commerciale è progettato per eseguire test sulla gamba sinistra, ma la configurazione può essere modificato per eseguire test sulla gamba destra pure. In secondo luogo, leverismi muscolari possono essere scelti in base alle dimensioni dell'animale, così gli utenti devono garantire che la piattaforma utilizzata è adeguata per misurare e sostenere la forza prodotta dal modello animale di scelta. muscoli verificabili per la piattaforma siano limitate a quelli che inducono estensione plantare o dorsiflessione del piede. In terzo luogo, va ancora una volta sottolineato che il posizionamento degli elettrodi può essere difficile e richiede pazienza e pratica per apprendere la tecnica. Elettrodi anche diventare noioso rapidamente con l'uso regolare, quindi è utile avere diverse s pezziETS per una volta diventa difficile per pungere la pelle superficialmente. In terzo luogo, il protocollo descritto in questo report utilizza sequenze di stimolazione specifici e le procedure di analisi dei dati. La leva di muscolo software di controllo del sistema e dei dati software di analisi e dei dati che fornisce può rispondere a molte altre domande sperimentali e di conseguenza, la sua utilità si estende oltre ciò che viene descritto nel presente documento. Come tale, gli utenti sono incoraggiati a esplorare oltre i limiti del protocollo software (s) presentato in questo documento. Nonostante queste limitazioni minori, test in vivo funzione muscolare è un approccio efficace per determinare la capacità di salute e contrattile del muscolo scheletrico perché è minimamente invasiva e può essere effettuata in diverse occasioni, su un periodo di tempo prolungato, sullo stesso animale. In breve, questo tipo di utility utile rende il sistema particolarmente abile a testare gli effetti di nuove terapie per le lesioni muscolo scheletrico o malattia nel topo arti posteriori.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.
Materials
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
| Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
| Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
| Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
| Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
| Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
| VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
| T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | rip in half to make thinner strips |
| A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
| Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
| Alcohol Swabs | |||
| 200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
| cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
| Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
| servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
| Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
| Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
| High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
| Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
| Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |
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