PI (4,5) P2 régule diverses fonctions cellulaires, mais son organisation à l' échelle nanométrique dans la membrane plasmique de la cellule est mal comprise. Par étiquetage PI (4,5) P 2 avec une sonde fluorescente à double couleur fusionnée au domaine Pleckstrin Homology, nous décrivons une nouvelle approche pour étudier la PI (4,5) P2 distribution spatiale dans la membrane plasmatique à l'échelle du nanomètre .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Phosphoinositides contribuent à une petite partie des lipides totaux de la membrane, mais jouent un rôle critique dans une variété de processus cellulaires. Ils comprennent sept membres issus de la phosphorylation réversible ou déphosphorylation des anneaux d'inositol sur le 3 e, 4 e et 5 e positions 1. Phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) et le 4,5-bisphosphate de phosphatidylinositol (PI (4,5) P2) sont deux phosphoinositides principaux qui fonctionnent de façon relativement indépendante les lipides déterminants de la membrane plasmique de la cellule (PM) 2,3. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) est beaucoup moins abondant que PI4P et PI (4,5) P2, mais il a des fonctions uniques à différents processus cellulaires , y compris le cancer et le diabète 4 5. Ces lipides ont des interactions moléculaires complexes avec leurs effecteurs et de nombreuses autres protéines. Par conséquent, il est crucial de comprendre l'organisation spatiale de ces phosphoinositides du PM à l'échelle du nanomètre.
Preuves de montage a montré que des complexes de protéines ou amas de molécules dans les zones de PM confinés peuvent servir de points d' accès 6 signalisation. Par exemple, la syntaxine 1a, une protéine clé qui régule la fusion membranaire 7-9, affiche l' organisation du cluster dans le PM. Distinct du consensus de l'organisation du groupe de syntaxine 1a, la distribution spatiale des phosphoinositides dans la PM est controversée. Motifs PI (4,5) P2 de distribution uniforme vont de 10-12, de grandes plaques 13,14, denses grappes 14-18, en fonction des types de cellules et des méthodes expérimentales utilisées. L'organisation spatiale de PI (4,5) P 2 à plus haute résolution est également incompatible. Une étude utilisant stimulée émission-déplétion (STED) microscopie 19 a révélé un grand nombre de PI dense (4,5) P 2 nano-clusters (~ 73 nm de diamètre) dans les PM feuilles de cellules PC-12 20 </sup>. Ce résultat est différent des études utilisant la microscopie électronique à congélation rapide (EM) 21,22, une approche qui préserve la structure PM intacte de cellules vivantes beaucoup mieux que la fixation chimique. Ce dernier a montré piscines distinctes de PI (4,5) P 2; PI relativement concentré (4,5) P 2 en cavéoles et enduits fosses ainsi que la distribution uniforme sur la région plane PM. De plus, PI à l' échelle nanométrique (4,5) P 2 organisation dans les feuilles de membrane peut varier dans des cellules vivantes et fixes. Notre travail récente a examiné cette question à la fois fixes et vivre cellules INS-1 en utilisant la microscopie de localisation seule molécule (SMLM) 23.
SMLM est basé sur la commutation stochastiquement sur un petit sous-ensemble de fluorophores à un moment donné afin que les fluorophores individuels peuvent être localisés avec une précision élevée. De nombreuses approches d'imagerie super-résolution ont été développés en utilisant des principes similaires à dépasser la limite de diffraction de la microscopie optique classique, un telLa microscopie s de photoactivation de localisation (PALM) 24, microscopie à fluorescence photoactivation de localisation (FPALM) 25, stochastique microscopie reconstruction optique (STORM) 26,27 et STORM directe (dSTORM) 28. Avec photo-commutables ou fluorophores photoactivables (colorants ou protéines fluorescentes), les techniques de SMLM permettent aux scientifiques de structures biologiques d'image à résolution nanométrique 24,29,30 avec vidéo-débit dans les cellules vivantes 31,32.
Utilisation de PI (4,5) P 2 à titre d'exemple, nous avons introduit l'approche SMLM pour étudier la distribution à l' échelle nanométrique de phosphoinositides sur le PM. Le domaine de pH de PLCδ1 (phospholipase C δ1) qui se lie spécifiquement à PI (4,5) P2 est une sonde bien établie pour l' imagerie de distribution PI (4,5) P2 sub-cellulaire et de la dynamique 33,34 dans la MP . Nous avons génétiquement marqué ce domaine avec deux protéines fluorescentes, PAmCherry1 35 et 36 IRFP </sup> pour produire un double-couleur de protéine de fusion (IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (Figure 1A-B). PAmCherry1 sert la sonde photoactivable du domaine PH pour PALM et IRFP sert d'indicateur général pour identifier les cellules transfectées avant l' acquisition PALM . Nous appliquons cette sonde fluorescente à double couleur pour l'imagerie SMLM dans les feuilles de membrane fixe. Pour l' imagerie de PALM en direct, nous avons marqués mEOS3 37 au lieu de PAmCherry1 au domaine PH de PLCδ1 pour générer la sonde PLCδ1 mEOS3.1-PH pour son meilleur rendement photonique et de la luminosité (figure 1C-D).
Imagerie SMLM avec ces nouvelles sondes dans le PM de insulinosécrétrices cellules INS-1 38 a permis de découvrir l' étiquetage homogène de PI (4,5) P2 dans la plupart des régions PM ainsi que PI concentré (4,5) P 2 microdomaines qui sont faiblement entremêlées dans le PM plat et certaines structures de filopodes comme 23. Puis unRépartition noscale de PI (4,5) P 2 fournit une base structurelle pour repenser la façon dont il fonctionne dans les cellules vivantes.
Pour le dépannage, deux processus nécessitent une attention particulière: la production de la feuille membrane et fixation échantillon. Comme décrit dans le protocole, le temps d'incubation des lamelles à l'étape 1.1.6 est importante pour la production de feuille de membrane. Temps d'incubation optimale sous notre condition expérimentale est 7-10 min (Figure 2). Plus de 10 minutes d'incubation va produire des cellules intactes au lieu des feuilles de membrane sur des lamelles PDL et incubation plus courte conduira à moins ou aucune feuille de membrane sur les lamelles PDL revêtues. Comme décrit dans le protocole, les fixatifs et la température au cours de la fixation sont essentielles pour le maintien de la PI (4,5) P2 distribution dans le PM. Fixation à la température ambiante ou l'utilisation de 4% -PFA seule pourrait fausser la répartition des lipides normale dans le PM.
En appliquant la microscopie PALM à la membrane recherche lipidique, nous sommes en mesure d'observer la distribution à l'échelle nanométrique de PI (4,5) P 2, une phosphoinositide clé qui médie mtoutes les activités cellulaires fondamentales. Cette répartition spatiale de la PI (4,5) P 2 avec des gradients de concentration limitées cellules INS-1 fournit un cadre pour repenser les interactions lipide-protéine et des événements de signalisation locaux de PI (4,5) P 2 dans ces cellules. En outre, les méthodes développées dans ce travail peuvent également être appliquées à d'autres recherches de phospholipides de la membrane avec des sondes appropriées, ce qui, en offrant de nouveaux outils pour étudier phosphoinositides dans les processus biologiques.
L'utilisation de feuilles de membrane dans ce travail contourne deux préoccupations majeures dans les études morphologiques phospholipides: traitement de détergent et de contamination potentielle du signal du cytosol. Détergents provoquent souvent le regroupement et une perte significative de signal de phospholipides PM. La contamination des signaux cytosolique est particulièrement problématique dans le cas de phosphoinositides de faible abondance sur le PM 23, tels que PI (3,4,5) P 3 et PI (3,4) P2. Des échantillons de feuille de membrane sont capables de circumvent ces problèmes sans perturber de manière significative des structures associées à la membrane plasmique, tels que le maillage d'actine corticale et des puits recouverts de clathrine 42,43. La répartition homogène relative de PI (4,5) P2 dans le PM est en bon accord avec d' autres études congélation EM rapides utilisant des sondes δ1 GST-PH PLC dans la membrane de fibroblaste 44.
Il est important de noter que des conditions inadéquates de traitement des échantillons peuvent générer des résultats trompeurs. Tout d'abord, il est essentiel d'effectuer les étapes de fixation à une température inférieure (4 ° C) et utiliser le fixateur GA pour la production de feuille de membrane. Comme le montre la figure 3, la température chaude et PFA fixation sans GA ne suffit pas de fixer phosphoinositides dans la cellule PM. Cela pourrait fausser le PI intact (4,5) P 2 distribution et générer des grappes pointues qui ne sont pas observés dans les cellules vivantes dans des conditions physiologiques. En second lieu, l'utilisation de PAmCherry1 quela sonde SMLM, plutôt que d'autres sondes, est essentiel pour l'imagerie quantitative de PALM. Le bénéfice de l' application PAmCherry1 provient de ses propriétés bien caractérisées simples moléculaires photo-physique 35,40,45, tels que la luminosité, l' efficacité photo-activation élevée et surtout, très limité photo clignotant. Ces propriétés permettent d'éliminer les artefacts de cluster potentiels de photo-clignoter et quantitativement analyser la densité moléculaire de PI de la membrane (4,5) P 2.
Cette approche a aussi ses limites. Tout d' abord, la méthode de la feuille de membrane utilisée dans cette étude ne peut pas reproduire entièrement la distribution physiologique de PI (4,5) P2 parce que la cellule est interrompue avant l' imagerie. Cependant, notre imagerie en temps réel PALM montre similaire répartition relativement homogène de PI (4,5) P2, supportant les résultats observés sur des échantillons de feuille de membrane. Deuxièmement, comme nous avons discuté dans nos travaux précédents 23, SMLM nécessite une expertise d'imagerie et supplémentaire àtention pour éviter des artefacts d'imagerie qui pourraient résulter de différents processus, y compris les sondes utilisées, la préparation des échantillons et de fixation, l'image d'échantillonnage et de reconstruction. Enfin, bien que des sondes et des anticorps en fonction du domaine de PH de ont été largement utilisés dans les études de phosphoinositide 46,47 il est possible que pas tous PI (4,5) P2 dans la membrane peut être détectée par cette méthode. Par exemple, PI (4,5) P 2 lié par d' autres protéines endogènes peuvent ne pas être accessibles aux sondes de pH ou des anticorps, et cela peut entraîner une sous – estimation de la PI (4,5) P 2 en raison de l'encombrement de l' espace de se sonder. Un autre moyen de marquage PI (4,5) P2 utiliserait les plus Fluor PI (4,5) P2 48, PI préétiqueté (4,5) P2 analogique avec une modification sur la queue d'origine PI (4,5) P2. Cependant, il peut être converti rapidement dans d'autres sous-types de phosphoinositide par le métabolisme des cellules vivantes rapide depuis son cycle inositol est le même que endogenous PI (4,5) P2. Cela soulève le problème de savoir si cette PI pré-étiquetés (4,5) P 2 analogiques dans des cellules vivantes peut représenter fidèlement PI (4,5) P 2 plutôt que de ses produits métaboliques. Par conséquent, en dépit de certaines limitations, des sondes à base de domaine de PH sont toujours parmi les meilleures sondes qui ont été largement utilisés pour surveiller PI (4,5) P2 distribution et la dynamique de la PM des cellules.
L'application future de cette méthode peut être étendue à d' autres études de phosphoinositide, comme PI (3,4,5) P 3 et PI (3,4) P2. En résumé, l'approche SMLM roman utilisée ici ouvre de nouvelles voies pour étudier phosphoinositide dans les cellules. Utilisation de PI (4,5) P2 , par exemple, nous démontrons les propriétés uniques de l' imagerie palme dans l'étude morphologique et quantitative des molécules de la membrane cellulaire, ainsi que ses inconvénients. Cette approche peut être adaptée à d'autres molécules d'intérêt, et aura de larges applications en biologie cellulaire.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |