PI (4,5) P2 regelt diverse cellulaire functies, maar de nanoschaal organisatie in de cel plasmamembraan wordt slecht begrepen. Etikettering PI (4,5) P2 met een dubbele-color fluorescent probe gefuseerd met het Pleckstrin homologie domein beschrijven we een nieuwe benadering voor het bestuderen PI (4,5) P2 ruimtelijke verdeling in het plasmamembraan op nanometerschaal .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Phosphoinositides bijdragen tot een klein deel van de totale membraanlipiden, maar spelen cruciale rol in verschillende cellulaire processen. Zij omvatten zeven leden afkomstig zijn van omkeerbare fosforylering of defosforylering van de inositol ringen op de 3 e, 4 e en 5 e positie 1. Fosfatidylinositol-4-fosfaat (PI4P) en fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) zijn twee belangrijke fosfoinositiden die relatief onafhankelijk functioneren als de determinant van lipiden celplasmamembraan (PM) 2,3. Fosfatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) veel minder overvloedig dan PI4P en PI (4,5) P2, maar het heeft unieke functies in verschillende cellulaire processen waaronder kanker 4 jp 5 diabetes. Deze lipiden complexe moleculaire interacties met hun effectoren en vele andere proteïnen. Daarom is het cruciaal om de ruimtelijke organisatie van deze pho begrijpensphoinositides in de PM op nanometerschaal.
Steeds meer bewijs heeft aangetoond dat eiwitcomplexen of molecuul clusters in de beperkte PM gebieden signalering hotspots 6 kan dienen. Bijvoorbeeld, Syntaxin 1a, een belangrijk eiwit dat membraanfusie 7-9 regelt, geeft de cluster organisatie in de PM. Onderscheiden van de consensus van de cluster organisatie van Syntaxin 1a, de ruimtelijke verdeling van phosphoinositides in de PM controversieel. PI (4,5) P2 distributie patronen variëren van uniforme 10-12, grote stukken 13,14, clusters 14-18, afhankelijk van celtypen en experimentele methoden dicht. De ruimtelijke organisatie van PI (4,5) P2 bij hogere resolutie is inconsistent. Een onderzoek waarbij gestimuleerde emissie-depletie (STED) microscopie 19 heeft een groot aantal dichte PI (4,5) P2 nano-clusters geopenbaard (~ 73 nm in diameter) in de PM vellen PC-12 cellen 20 </sup>. Dit resultaat is iets anders dan studies met behulp van snel invriezen elektronenmicroscopie (EM) 21,22, een benadering die de intacte PM structuur van levende cellen veel beter dan chemische fixatie behouden blijft. De laatste vertoonde verschillende pools van PI (4,5) P2; relatief geconcentreerd PI (4,5) P2 in caveolae en gecoate pits evenals uniforme verdeling op het vlakke gebied PM. Bovendien kan nanoschaal PI (4,5) P2 organisatie membraanlagen verschillen levende en gefixeerde cellen. Onze recente werk onderzocht dit probleem in zowel vaste en live INS-1-cellen met behulp van single-molecule lokalisatie microscopie (SMLM) 23.
SMLM is gebaseerd op stochastisch inschakelen slechts een klein deel van fluoroforen op een gegeven moment zodat afzonderlijke fluoroforen kunnen worden gelokaliseerd met hoge precisie. Veel superresolutie imaging benaderingen ontwikkeld met vergelijkbare beginselen op de diffractie limiet van conventionele lichtmicroscopie overtreffen dergelijkes fotoactivatie lokalisatie microscopie (PALM) 24, fluorescentie fotoactivatie lokalisatie microscopie (FPALM) 25, stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) 26,27 en directe STORM (dSTORM) 28. Met foto-schakelbare of fotoactiveerbare fluoroforen (kleurstoffen of fluorescerende eiwitten), SMLM technieken kunnen wetenschappers het biologische structuren op nanometer resolutie 24,29,30 met video-tarief in levende cellen 31,32.
Gebruik PI (4,5) P2 als voorbeeld stelden we de SMLM benadering nanoschaal verdeling van phosphoinositides op de PM bestuderen. Het PH domein van PLCδ1 (fosfolipase C δ1) dat specifiek bindt PI (4,5) P2 een gevestigde probe voor beeldvorming PI (4,5) P2 subcellulaire distributie en dynamica 33,34 in de PM . We hebben genetisch gelabeld dit domein met twee fluorescerende eiwitten, PAmCherry1 35 jp 36 iRFP </sup> om een dual-color fusie-eiwit (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) te produceren (Figuur 1A-B). PAmCherry1 dient als de fotoactiveerbare probe van PH-domein voor PALM en iRFP dient als een algemene indicator om getransfecteerde cellen te identificeren voordat PALM overname . We passen deze dual-color fluorescente probe voor SMLM beeldvorming in het vaste membraan vellen. Voor live PALM imaging, we hebben mEOS3 37 in plaats van PAmCherry1 aan de PH PLCδ1 domein naar het mEOS3.1-PH PLCδ1 probe voor het beter foton efficiency en helderheid (figuur 1C-D) te genereren.
SMLM beeldvorming met deze nieuwe probes in de PM van insuline uitscheidende INS-1-cellen 38 heeft homogene kenmerken van PI (4,5) P2 in de meeste PM regio's en geconcentreerd PI (4,5) P2 onbedekt microdomeinen dat dun zijn vermengd in de flat PM en sommige filopodia-achtige structuren 23. Dan eennoScale verdeling van de PI (4,5) P2 levert een structurele basis voor heroverwegen hoe het functioneert in levende cellen.
Voor het oplossen van problemen, twee processen moeten extra aandacht: membraan productie blad en sample fixatie. Zoals beschreven in het protocol, de incubatietijd van de dekglaasjes in stap 1.1.6 is belangrijk membraanplaat productie. Optimale incubatietijd onder onze experimentele conditie 7-10 min (figuur 2). Langer dan 10 minuten incubatie worden intacte cellen in plaats van de membraanlagen op PDL dekglaasjes en kortere incubatie produceren leidt tot minder of geen membraanlagen op de PDL-gecoate dekglaasjes. Zoals beschreven in het protocol, de fixeermiddelen en temperatuur tijdens fixatie kritisch voor het handhaven van de PI (4,5) P2 verdeling in de PM. Fixatie bij RT of het gebruik van 4% -PFA alleen kon de normale lipide-verdeling in de PM verstoren.
Door het toepassen van PALM microscopie om lipide onderzoek membraan, zijn we in staat om de nanometerschaal verdeling van de PI in acht (4,5) P2, een belangrijke fosfoinositide dat m bemiddeltgeen fundamentele cellulaire activiteiten. Deze ruimtelijke verdeling van de PI (4,5) P2 met een beperkte concentratie gradiënten in INS-1-cellen biedt een kader voor heroverweging lipide-eiwit interacties en lokale signalering gebeurtenissen van PI (4,5) P2 in deze cellen. Bovendien ontwikkelde deze werkwijzen kunnen ook worden toegepast op andere membraanfosfolipide onderzoek met de juiste probes daardoor met nieuwe instrumenten te phosphoinositides in biologische processen te bestuderen.
Het gebruik van membraan bladen in dit werk omzeilt twee belangrijkste aandachtspunten in fosfolipiden morfologische studies: detergent behandeling en mogelijke signaal verontreiniging van het cytosol. Wasmiddelen veroorzaken vaak clustering en significant verlies van PM fosfolipiden signaal. De verontreiniging van cytosolische signaal bijzonder problematisch bij lage abundantie phosphoinositides de PM 23, zoals PI (3,4,5) P3 en PI (3,4) P2. Membraan sheet monsters zijn in staat om circumvent deze problemen zonder significante verstoring structuren geassocieerd met het plasmamembraan, zoals corticale actine vlechtwerk en clathrine gecoate pits 42,43. De relatieve homogene verdeling van PI (4,5) P2 in de PM is in goede overeenstemming met andere invriesapparaat EM studies met GST-PH PLC δ1 probes in de fibroblast membraan 44.
Het is belangrijk op te merken dat de onjuiste verwerking monster omstandigheden misleidende resultaten kan genereren. Ten eerste is het essentieel om de fixatie stappen uit te voeren bij een lagere temperatuur (4 ° C) en gebruik het fixeermiddel GA van membraanplaat productie. Zoals getoond in figuur 3, warme temperatuur en PFA fixatie zonder GA is niet voldoende om phosphoinositides in cel PM bevestigen. Dit zou de intacte PI (4,5) P2 distributie verstoren en het genereren van sterke clusters die niet zijn waargenomen in levende cellen onder fysiologische omstandigheden. Ten tweede, het gebruik van PAmCherry1 alsSMLM de probe in plaats van andere sondes, is cruciaal voor de kwantitatieve PALM beeldvorming. Het voordeel van PAmCherry1 verzoek komt uit de goed gekarakteriseerde moleculaire één foto-fysische eigenschappen 35,40,45, zoals helderheid, hoge fotoactivering efficiëntie en bovenal zeer beperkte foto-knipperen. Deze eigenschappen stellen ons in staat om potentiële cluster artefacten van foto-knipperen elimineren en kwantitatieve analyse van de moleculaire dichtheid van membraan PI (4,5) P2.
Deze aanpak heeft ook zijn beperkingen. Ten eerste kan de membraanlaag methode die in dit onderzoek niet volledig bootsen de fysiologische verdeling van PI (4,5) P2, omdat de cel wordt onderbroken voor de beeldvorming. Echter, onze live PALM imaging geeft zelfde relatief homogene verdeling van de PI (4,5) P2, het ondersteunen van de resultaten waargenomen met membraan blad monsters. Ten tweede, zoals we in onze vorige werk 23 besproken, SMLM vereist imaging expertise en extra opTENTION om imaging artefacten die kunnen voortvloeien uit verschillende processen, met inbegrip van de probes gebruikt, monstervoorbereiding en fixatie, afbeelding bemonstering en wederopbouw te vermijden. Tenslotte, hoewel de PH-domein probes en antilichamen zijn op grote schaal gebruikt in fosfoinositide studies 46,47 blijft het mogelijk dat niet alle PI (4,5) P2 in het membraan kan worden gedetecteerd door deze benadering. Bijvoorbeeld kan PI (4,5) P2 bindend andere endogene eiwitten niet toegankelijk PH probes of antilichamen, en dit kan een onderschatting van PI (4,5) P2 veroorzaken vanwege de ruimte belemmering van sonde zelf. Een alternatieve manier voor het merken PI (4,5) P2 zou gebruiken hoogst Fluor PI (4,5) P2 48 een gelabelde PI (4,5) P2 analoog met een modificatie op de staart van originele PI (4,5) P2. Het kan echter snel worden omgezet in andere fosfoinositide subtypes door snelle levende celmetabolisme sinds de inositol ring gelijk endogenous PI (4,5) P2. Dit kan ertoe leiden of deze gelabelde PI (4,5) P2 analogon in levende cellen getrouw kan vertegenwoordigen PI (4,5) P2 in plaats metabolieten daarvan. Daarom, ondanks bepaalde beperkingen, PH-domein probes nog steeds tot de beste probes die op grote schaal gebruikt voor het bewaken PI (4,5) P2 distributie en dynamiek op de PM van cellen.
De latere toepassing van deze methodologie kan worden uitgebreid tot andere studies fosfoinositide, zoals PI (3,4,5) P3 en PI (3,4) P2. Samengevat, de nieuwe benadering SMLM hier gebruikt opent nieuwe wegen om fosfoinositide bestuderen in cellen. Gebruik PI (4,5) P2 als voorbeeld tonen we de unieke eigenschappen van PALM beeldvorming in de morfologische en kwantitatief onderzoek van celmembraan moleculen en nadelen. Deze benadering kan worden aangepast aan andere moleculen van belang en brede toepassingen in celbiologie hebben.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |